膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的顱內(nèi)腫瘤，往往呈侵襲性的生長(zhǎng)方式，跟正常的腦組織邊界不清楚，所以手術(shù)切除非常困難，復(fù)發(fā)率非常高，往往難以治愈。通過聯(lián)合手術(shù)、聯(lián)合放療化療在內(nèi)的綜合治療，臨床報(bào)道平均生存期大概僅15個(gè)月左右。因此，產(chǎn)生了對(duì)新療法的迫切需求。
免疫毒素療法在治療癌癥方面具有巨大潛力，最近的研究發(fā)現(xiàn)，D2C7免疫毒素（D2C7-IT）在GBM小鼠模型和用D2C7治療的患者顯示出有希望的結(jié)果，但其療效有限。GBM腫瘤具有難以置信的異質(zhì)性，導(dǎo)致治療耐藥性，此外，癌癥和腫瘤相關(guān)細(xì)胞經(jīng)常分泌蛋白或表達(dá)受體，抑制免疫活性，從而形成阻礙療效的免疫抑制環(huán)境。需要新的策略來克服GBM TME的挑戰(zhàn)。
刺激免疫活性的分子可以幫助克服癌癥細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制。CD40是一種由不同類型細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子，可增強(qiáng)T細(xì)胞活性和抗腫瘤免疫?？笴D40的激動(dòng)劑抗體已被證明可激活適應(yīng)性免疫和先天免疫，并可特別有效地對(duì)抗CD40高表達(dá)的癌癥類型，包括GBM。
免疫細(xì)胞的功能分析顯示了療法如何影響免疫活動(dòng)，但群體分析可能會(huì)漏掉每個(gè)細(xì)胞的關(guān)鍵特征。IsoPlexis的單細(xì)胞分泌解決方案幫助研究人員分析單個(gè)細(xì)胞的功能，為免疫反應(yīng)和驅(qū)動(dòng)免疫活動(dòng)的細(xì)胞功能提供更深入的見解。
最近杜克大學(xué)發(fā)表在Science Translational Medicine上一篇新的論文，題為“Immunotoxin-αCD40 therapy activates innate and adaptive immunity and generates a durable antitumor response in glioblastoma models”（免疫毒素-αCD40療法激活先天性和適應(yīng)性免疫，并在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中產(chǎn)生持久的抗腫瘤反應(yīng)），研究人員評(píng)估了免疫毒素和抗CD40激動(dòng)劑聯(lián)合治療GBM的療效。
研究思路
研究者采用遞送增強(qiáng)型給藥方法（convection-enhanced delivery，簡(jiǎn)稱CED），將導(dǎo)管（catheter）直接插入腫瘤之中，并通過注射泵（infusion pump）給予導(dǎo)管正壓力，從而促進(jìn)藥物分布吸收。通過CED實(shí)現(xiàn)生物大分子直接瘤內(nèi)給藥，這些大分子往往難以通過血腦屏障，或者系統(tǒng)給藥時(shí)毒性太高。
他們比較了四個(gè)治療組中GBM小鼠模型的生存情況，分別為：
- Ctrl – 對(duì)照組no D2C7 or ɑCD40
- D2C7 – D2C7 單藥
- CD40 - ɑCD40 單藥
- D + C – D2C7 + ɑCD40 聯(lián)合用藥
在確定安全劑量后，研究人員表明，聯(lián)合療法能夠誘導(dǎo)免疫記憶，最終改善GBM模型的存活率。研究人員接下來檢查了受聯(lián)合療法影響的免疫細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）是該療法抗腫瘤作用所必需的。
文章的幾個(gè)部分利用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)對(duì)治療組腫瘤微環(huán)境中的某些免疫標(biāo)記物進(jìn)行表面表型和評(píng)估，發(fā)現(xiàn)：
- 聯(lián)合治療增加了促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的存在；
- CD8+T細(xì)胞是D+C聯(lián)合的有效性所必需的；
- D+C聯(lián)合導(dǎo)致CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）的增加；
- 盡管這些TIL耗竭，但D+C治療組的CD8+TIL仍相當(dāng)活躍；
- D+C聯(lián)合組的TIL增殖性更強(qiáng)，表明細(xì)胞毒性更強(qiáng)；
- D+C聯(lián)合的療效可以通過改變Batf3水平來調(diào)節(jié)，因?yàn)锽atf3參與支持串?dāng)_和免疫群體（包括TIL）的擴(kuò)增。
此外，來自腫瘤的RNA-seq顯示，D+C聯(lián)合治療的小鼠腫瘤中促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄物的增加。
單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)揭示增強(qiáng)的CD8+功能
由于聯(lián)合療法旨在刺激免疫細(xì)胞功能，研究人員使用IsoPlexis的單細(xì)胞分泌組來表征CD8+TIL活性。在四個(gè)治療組（Ctrl、D2C7、CD40和D+C）中從GBM腫瘤中分離出CD8+TIL細(xì)胞，在37℃下用PMA/Iono刺激處理5小時(shí)，然后在小鼠單細(xì)胞適應(yīng)性免疫芯片上檢測(cè)細(xì)胞因子分泌組，并通過生信分析單細(xì)胞多功能亞群（分泌2種以上因子的細(xì)胞亞群）和細(xì)胞多功能指數(shù)（PSI）。
在CT-VIII膠質(zhì)瘤治療后6天，單個(gè)CD8+T細(xì)胞對(duì)不同療法的反應(yīng)，與對(duì)照組相比，D2C7、αCD40和D+C處理的小鼠顯示出增強(qiáng)的多功能性和多功能強(qiáng)度指數(shù)（PSI）。雖然單藥治療增加了多功能細(xì)胞的數(shù)量，但只有聯(lián)合治療導(dǎo)致分泌5種或更多不同家族的細(xì)胞因子/趨化因子的高度多功能細(xì)胞亞群。
利用熱圖可視化來更好地了解治療組中分泌的細(xì)胞因子/趨化因子，評(píng)估分泌的單個(gè)細(xì)胞因子表明，免疫毒素和聯(lián)合療法都增加了分泌的細(xì)胞因子的多樣性，表明多功能細(xì)胞具有促炎表型，從蛋白組層面進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA-seq的發(fā)現(xiàn)。D+C聯(lián)合治療的小鼠CD8+TIL細(xì)胞在各種家族中分泌10種以上的細(xì)胞因子/趨化因子，這些高度分泌的CD8+TIL僅在D+C治療組中發(fā)現(xiàn)。通過使用單細(xì)胞功能表型，研究人員能夠識(shí)別驅(qū)動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的CD8+TIL亞群，并表明他們的聯(lián)合治療可以提高T細(xì)胞功能，這符合他們最初的假設(shè)。
用單細(xì)胞分析評(píng)價(jià)新型免疫療法
IsoPlexis的單細(xì)胞功能分析展示了新型免疫療法如何在單細(xì)胞水平上影響免疫細(xì)胞功能，揭示了驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答的高度多功能細(xì)胞亞群。多功能性和PSI是抗腫瘤療效的有價(jià)值的生物標(biāo)志物，使用單細(xì)胞功能分析來表征新的免疫療法可以確定關(guān)鍵見解，并有助于指導(dǎo)新療法的早期開發(fā)。
