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2025年，In Vivo CAR-T領域捷報頻傳：阿斯利康以總價10億美元收購EsoBiotec，將其工程化納米抗體慢病毒平臺收入囊中；艾伯維則以高達21億美元全現金收購了專注于該領域的Capstan Therapeutics。

巨頭的巨額押注，凸顯了In Vivo CAR-T的巨大潛力。相比傳統體外CAR-T，其優勢顯著：

表1：In Vivo與Allo CAR-T核心特點與臨床進展對比表

在In Vivo CAR-T開發中，遞送系統的選擇至關重要。目前，慢病毒載體因其可實現單次給藥、靶向性強、免疫原性低且臨床經驗豐富，成為主流選擇。然而，傳統的慢病毒生產工藝面臨滴度波動大、成本高、批次一致性差等挑戰，難以滿足體內治療的大規模生產需求。

破解這一瓶頸的關鍵在于穩定細胞系的開發。以深研生物的EuLV穩轉細胞系生產系統為例，通過使用可誘導的穩定生產細胞系，在化學成分確定的培養基中生產，實現了病毒產量提升近百倍、生產成本降低80%的巨大飛躍，為產業化奠定了堅實基礎。

圖1：穩轉細胞系構建路線圖

在構建穩定細胞系的過程中，最關鍵的一步是篩選出高產、高穩定性的單克隆細胞。而單細胞打印技術正是在這一環節發揮著“神助攻”的關鍵作用。

這項技術已在產業界得到成功驗證。例如，國際藥企葛蘭素史克（GSK）在其發表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》（2020）的研究中，詳細闡述了如何利用Cytena單細胞打印機，高效構建用于慢病毒載體生產的穩轉細胞系。

該研究通過單細胞打印篩選出的高產單克隆，在搖瓶規模下生產的未濃縮慢病毒載體功能性滴度即可穩定超過1×10? TU/mL，與高效瞬時轉染的產量相當（圖2）。

圖2：在搖瓶中通過瞬時轉染和穩定生產細胞系獲得慢病毒載體滴度圖。各點表示9個搖瓶中每個的滴度

更重要的是，這些由單克隆衍生的細胞系展現出卓越的遺傳穩定性——在連續傳代培養超過20個代次后，其載體滴度和整合的載體基因拷貝數均未發生顯著衰減(圖3）。

圖3：克隆在超過20個細胞倍增的過程中，功能滴度（TU/mL）和物理滴度（p24）保持穩定。

最終，該研究成功將篩選出的克隆放大至50升一次性攪拌罐生物反應器進行生產，單個批次即可收獲高達2×10¹¹總功能性TU的慢病毒載體（圖4），理論上足以滿足10名患者的治療需求。這一案例充分證明了基于單細胞打印的克隆篩選策略，是實現穩定、高產、可規模化慢病毒生產工藝的基石。

圖4：48小時后收獲50L批次的結果圖。未濃縮載體的功能滴度范圍為0.4 ~ 1.4 10⁷ TU_CEM/mL，感染性范圍為7 ~ 43 TU_CEM/pg p24。

隨著生物制藥行業對細胞系單克隆性的要求日益嚴格，單細胞打印技術的重要性將愈發凸顯。從GSK等企業的成功實踐可以看出，單細胞打印技術是產業化工藝中確保克隆源性、合規性與一致性的關鍵環節。它與慢病毒生產技術的深度融合，正推動細胞治療工藝向更高效、規范、可追溯的方向發展。未來，我們有望見證更多基于In Vivo CAR-T的治療方案獲批上市，為全球癌癥患者帶來新的希望。而單細胞打印技術，將繼續作為幕后功臣，在這一進程中扮演不可或缺的角色。