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從6個(gè)月大的α-synuclein A53T轉(zhuǎn)基因小鼠（α-syn-A53T）和匹配的野生型小鼠（WT）中解剖小腦、中腦和紋狀體樣本，進(jìn)行單核測(cè)序（圖1A）。為了對(duì)主要細(xì)胞類型進(jìn)行分類，我們結(jié)合了來(lái)自α-syn-A53T和WT的細(xì)胞（中腦：8809個(gè)來(lái)自α-syn-A53T的細(xì)胞和5202個(gè)來(lái)自WT的細(xì)胞；紋狀體：12780個(gè)來(lái)自α-sin-A53T的細(xì)胞和5441個(gè)來(lái)自WT；小腦：10312個(gè)來(lái)自α-scyn-A53T的細(xì)胞和3452個(gè)來(lái)自WT的細(xì)胞），然后進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類（圖1B）。所得簇顯示出不同的表達(dá)模式（圖1C）。所得簇顯示出不同的表達(dá)模式（圖1C）。根據(jù)報(bào)告的標(biāo)記，我們將簇分配給已知的細(xì)胞類型，包括GABA能神經(jīng)元（MB_GABA、ST_GABA、CB_GABA）、谷氨酸能神經(jīng)元（MB_GLU、CB_GLU）、5-羥色胺能神經(jīng)元（MB _SER）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（MB_OLG、ST_OLG_1、ST-OLG_2、CB_OLG）、少膠質(zhì)前體細(xì)胞（MB_OPC、ST-OPC、CB_OPC）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（MB _AST、ST_AST_1、ST_ATS_2、CB_AST）、小膠質(zhì)細(xì)胞（MB_MG、ST_MG_1、ST_MC_2、CB_MG）、血管細(xì)胞（MB_VA）、內(nèi)皮細(xì)胞（ST_END）和周細(xì)胞（MB_PEC、ST_PEC、CB_PEC）。我們還確定了區(qū)域特異性細(xì)胞類型：中腦多巴胺能神經(jīng)元（MB_DA）、中棘神經(jīng)元（ST_MSN_D1、ST_MSN-D2）、膽堿能中間神經(jīng)元（ST_CHO）、未成熟神經(jīng)元（ST_IMN）、紋狀體神經(jīng)祖細(xì)胞（ST_NPC）和浦肯野細(xì)胞（CB_PC）以及小腦顆粒細(xì)胞（CB_GC）（圖1B、1C、S2）。每種細(xì)胞類型差異表達(dá)的基因的功能富集分析為細(xì)胞類型分配提供了進(jìn)一步的證據(jù)（圖1D）。

2. snRNA-seq揭示α-syn-A53T中腦轉(zhuǎn)錄組學(xué)異質(zhì)性

根據(jù)α-syn-A53T和WT的不同樣本，將同一簇的細(xì)胞分裂（圖2A）。中腦中的所有細(xì)胞類型在兩個(gè)樣本中都是共享的。盡管如此，人們發(fā)現(xiàn)還有另一個(gè)細(xì)胞簇，定義為與PD相關(guān)的細(xì)胞（MB_AP），僅出現(xiàn)在α-syn-A53T中腦（圖2A），不表達(dá)任何已知的細(xì)胞標(biāo)志物（圖1C）。據(jù)推測(cè)，MB_AP是一組受α-syn基因敲入影響的細(xì)胞，由中腦內(nèi)不同類型的細(xì)胞組成。由于在敲入基因的影響下，一些相似的細(xì)胞進(jìn)程發(fā)生了變化，細(xì)胞表達(dá)了相似的特征并聚集在一起。為了確保差異表達(dá)基因（DEGs）的統(tǒng)計(jì)能力，我們排除了α-syn-A53T或WT中少于三個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞類型。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，α-syn-AP3T和WT之間存在大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄改變。在中腦中總共鑒定出2045個(gè)上調(diào)的DEGs和496個(gè)下調(diào)的DEGs（圖2B；表S3），細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)譜如圖2C所示。

3. α-syn-A53T紋狀體基因表達(dá)的改變

根據(jù)α-syn-A53T和WT的兩個(gè)不同樣本對(duì)紋狀體細(xì)胞進(jìn)行分裂（圖3A），在紋狀體中鑒定出641個(gè)上調(diào)的DEGs和4608個(gè)下調(diào)的DEGs（圖3B）。紋狀體中細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)譜如圖3C所示，其中紋狀體中細(xì)胞對(duì)選定DEGs的表達(dá)是特異的（圖3D）。具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)D1型（DRD1）和D2型受體（DRD2）的表達(dá)，紋狀體MSNs可以進(jìn)一步分為兩類已知的MSNs。我們鑒定出D1型M-SN和D2型MSNs分別高度表達(dá)Drd1、Tac1和Drd2、Penk（表S2）。ST_GABA可以進(jìn)一步分為已知的亞群，包括Npy+Sst+（C2_SOM-1、C4_SOM-2、C8_SOM-3）、Vip+（C6_Vip）、Pvalb+（C1_Pvalb）、Th+（C7_Th）和Cck+（C5_Cck）（圖3E和3F）。除此之外，我們注意到C0和C3分別高度表達(dá)Foxp2和Igfbp4，這可能負(fù)責(zé)紋狀體中的特定功能（圖3E和3F）。ST_IMN的特征是未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物的不同表達(dá)，如Dcx（圖S2B）。在α-syn-A53T中上調(diào)的所有DEGs中，近三分之二在多種細(xì)胞類型中上調(diào)（圖3G），表明由于突變體Snca的插入，紋狀體中不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)變化具有一定的相似性。

4. α-syn-A53T小腦基因表達(dá)的改變

在小腦中，根據(jù)經(jīng)典的神經(jīng)元標(biāo)記物鑒定出GABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元浦肯野細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（圖4A和4B）。特別是在CB_AST中，除了經(jīng)典的AST標(biāo)記Slc1a3和Aqp4外，Bergmann膠質(zhì)細(xì)胞還被鑒定為Gdf10的高表達(dá)（圖4C和4D）。通過(guò)差異基因分析，我們?cè)谛∧X中鑒定出1636個(gè)上調(diào)的DEGs和233個(gè)下調(diào)的DEGs（圖4E和4F；表S3），與紋狀體相比，其中大多數(shù)DEGs對(duì)單一細(xì)胞類型具有特異性（圖4G）。

5. 與帕金森病密切相關(guān)的細(xì)胞類型的鑒定

接下來(lái)，我們?cè)噲D找到對(duì)PD進(jìn)展有顯著影響的特定細(xì)胞類型。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，使用從DisGeNET檢索的PD風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行了過(guò)度代表性分析（Piñero等人，2017）。由于AST已被深入報(bào)道通過(guò)將α-syn轉(zhuǎn)移到多巴胺能神經(jīng)元來(lái)促進(jìn)PD進(jìn)展，我們接下來(lái)檢查了AST的富集水平，發(fā)現(xiàn)PD風(fēng)險(xiǎn)基因在中腦和紋狀體AST群體中富集（包括MB_AST、ST_AST_1、ST_ATS_2），但在小腦中不富集（圖5A）。中腦和紋狀體中的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系（MB_OLG、MB_OPC、S_OLG_1、ST-OLG_2、ST-OPC和CB_OLG）在PD病理中起著模糊的作用，在不同程度上顯示出PD風(fēng)險(xiǎn)基因的強(qiáng)烈富集，這表明可能存在導(dǎo)致PD早期發(fā)生和發(fā)展的未經(jīng)探索的線索。具體來(lái)說(shuō)，ST_OLG_1的富集度得分為5.23，其次是ST_OPC的4.29，ST_OLG_2的4.01，MB_OLG的3.73，MB_OPC的1.85，CB_OLG的1.34(圖5A）。盡管如此，只有2種小腦細(xì)胞類型（CB_GABA、CB_OLG）富集了PD風(fēng)險(xiǎn)基因，這與先前的知識(shí)一致，因?yàn)樾∧X直到Braak V期才受到嚴(yán)重影響（Poewe等人，2017）。