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?基因敲除技術(shù)最新研究進(jìn)展—|基因敲除技術(shù)|轉(zhuǎn)基因研究|基因克隆|基因靶向操作|
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基因敲除技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上而發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)。1987年Thompsson建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型?。近年來(lái)新興起了ZFNs、TALENS、Cas9等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)為主的基因敲除技術(shù)。2012年1月基因組編輯核酸酶技術(shù)的《Nature?Methods>雜志評(píng)選為年度研究方法，2012年12月被Science雜志評(píng)為2012年度十大科學(xué)進(jìn)展之一。這些基因敲除技術(shù)極大地提高了基因敲除的效率，且具有極高的基因敲除特異性，為研究基因功能創(chuàng)造了新的途徑必將極大地推動(dòng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。現(xiàn)常用的基因敲除技術(shù)主要包括以下幾類。
1?傳統(tǒng)基因敲除方法
1．1?利用同源重組進(jìn)行基因敲除
基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而通過(guò)基因敲除達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低，增加了基因敲除實(shí)際操作的工作量，限制了基因敲除技術(shù)的應(yīng)用。而且，用單純的同源重組實(shí)現(xiàn)人類基因組的永久修復(fù)是不切實(shí)際的，這也嚴(yán)重阻礙了生物學(xué)研究的發(fā)展?。
1．2?利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除
大規(guī)模的隨機(jī)插入突變理論上可實(shí)現(xiàn)在基因組范圍內(nèi)對(duì)任一基因敲除。這項(xiàng)技術(shù)可提高基因敲除效率，使基因完全失活以及容易分離鑒定等優(yōu)點(diǎn)。目前較為有效的基因敲除方法是隨機(jī)插入突變可以分為T(mén)-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變，兩者是在植物中使用廣泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活技術(shù)可以直接在植物基因組DNA中產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變，而且插入位點(diǎn)的隨機(jī)性較強(qiáng)，但是只適用于那些容易被T-DNA轉(zhuǎn)化的植物，且常常會(huì)引起染色體重排現(xiàn)象，使突變體表型與T-DNA插入無(wú)關(guān)而難以進(jìn)行遺傳學(xué)分析。這種基因敲除方法在擬南芥中可產(chǎn)生35％?～40％的突變率，19％?的突變體具有外觀可察覺(jué)到的表型特征。近年這類基因敲除方法在擬南芥研究中應(yīng)用廣泛?。
2?新興的基因敲除技術(shù)
2．1?利用RNA干擾引起的基因敲除
RNA干擾是RNA依賴的基因沉默現(xiàn)象，是雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發(fā)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度為21～22?nt的siRNA，siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，R1SC以ATP依賴的方式催化雙鏈siRNA解旋，利用RISC內(nèi)部的單鏈siRNA，通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別與之互補(bǔ)的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，從而導(dǎo)致目的基因的沉默。因此，通過(guò)將dsRNA分子導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其同源的mRNA，封閉內(nèi)源性基因的表達(dá)來(lái)失活該基因同樣可以實(shí)現(xiàn)基因敲除。
2．2?鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)的基因敲除
鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)的核心設(shè)計(jì)思想是將2個(gè)有特定功能的結(jié)構(gòu)域，即特異性識(shí)別模塊和功能模塊融合，形成具有特定功能的蛋白。單個(gè)ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含3～6個(gè)Cys2一His2鋅指蛋白重復(fù)單位，能特異性識(shí)別1個(gè)三聯(lián)體堿基。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來(lái)自Fokl的c端的96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個(gè)Fokl單體與一個(gè)鋅指蛋門(mén)組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距6～8bp距離時(shí)，2個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點(diǎn)產(chǎn)生1個(gè)DNA雙鏈切口，然后利用細(xì)胞固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)，從而達(dá)到精確定點(diǎn)修飾的目的?。ZFN介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)，可以精確地修飾基因或其周圍的調(diào)控元件，可為研究人類疾病構(gòu)建良好的動(dòng)物模型，通過(guò)原核注射或胞質(zhì)注射獲得的基因敲除大鼠、基因敲除兔。存在同源區(qū)的外源DNA時(shí)，發(fā)生同源重組修復(fù)，能實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)敲入。
2．3?利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除
TALENs靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，被認(rèn)為是基因敲除技術(shù)發(fā)展的里程碑。TALENs靶向基因敲除的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是基于植物病原體黃單胞菌分泌的一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子可以識(shí)別DNA序列的原理。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊蛋白。TAL蛋白中的DNA結(jié)合域與Fokl核酸內(nèi)切酶的切割域融合，在特異的位點(diǎn)打斷目標(biāo)基因，進(jìn)而在該位點(diǎn)進(jìn)行DNA操作，如基因敲入(Knock—in)、基因敲除(Knock—nut)或定點(diǎn)突變。
2．4?Cas9基因敲除技術(shù)
2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats?(CRISPR/Cas9)出現(xiàn),主要由細(xì)菌和古細(xì)菌通過(guò)一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御系統(tǒng)改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系統(tǒng)依賴Cas9內(nèi)切酶家族靶向和剪切外源DNA,達(dá)到基因敲除目的。Cas9基因敲除技術(shù)的特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單，成本低，作用高效?。CRISPR/Cas9將進(jìn)一步靶向基因操縱推向高潮，使得多個(gè)基因敲除、敲入變得更為簡(jiǎn)單、高效。作為一種新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9有靶向精確性高、試驗(yàn)周期短、無(wú)物種限制、具有好的活性等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。不僅如此，CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)還可以同時(shí)針對(duì)同一細(xì)胞(Es)中的多個(gè)位點(diǎn)能實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)同時(shí)酶切，人們運(yùn)用該技術(shù)成功獲得斑馬魚(yú)等模式動(dòng)物基因敲除模型，使得多個(gè)基因敲除、敲入成為可能。雖然目前對(duì)該技術(shù)的特異性及免疫原性了解甚少，但隨著研究的不斷深入，一定會(huì)有很大的改善。
盡管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR這類基因敲除技術(shù)目前還處于研究的初期階段，其在基因敲除方面已表現(xiàn)出巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是靶向基因修飾的革新技術(shù)。由于這些新技術(shù)依然還有許多未知因素并沒(méi)有研究透徹，因此，在基因敲除技術(shù)方法的研究過(guò)程中，它們發(fā)揮的作用將不可限量。
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