作者：Monica Heger
上周在佛羅里達(dá)州馬可島舉行的基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì)AGBT上，Life Technologies表示其計(jì)劃在年中發(fā)布Ion Torrent Proton II芯片以及PI芯片的升級(jí)版，可通過200個(gè)堿基對(duì)讀數(shù)獲得16千兆堿基數(shù)據(jù)。
Life Technologies聲稱，在去年的離子世界大會(huì)上，公司同樣計(jì)劃推出PIII芯片，該芯片可通過100堿基對(duì)讀數(shù)獲得64千兆堿基數(shù)據(jù)，但是最終通過400堿基對(duì)讀數(shù)獲得了256千兆堿基數(shù)據(jù)(IS 9/18/2012)。 Ion Torrent 公司的創(chuàng)始人Jonathan Rothberg說，在上周的AGBT上，公司尚未宣布此類芯片的發(fā)布日期。
“除開發(fā)Proton系統(tǒng)外，公司正致力于改善樣品制備過程”， Rothberg說，“正如之前所宣布的，公司正在開發(fā)名為Avalanche的微乳液無PCR樣品制備系統(tǒng)”。
公司正著力開發(fā)多種版本的Avalanche系統(tǒng)，包括可以在Proton芯片上直接構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的系統(tǒng)。 Rothberg說，公司研究人員已對(duì)協(xié)議進(jìn)行了測(cè)試，并證實(shí)能完美讀取近600個(gè)堿基。
Life Technologies產(chǎn)品營(yíng)銷高級(jí)總監(jiān)Andy Felton解釋說，公司仍在決定如何使Avalanche商業(yè)化，尤其是是否應(yīng)使用磁珠配置進(jìn)行處理或者就在芯片上進(jìn)行簡(jiǎn)單處理。
Andy Felton未就向客戶提供Avalanche的具體時(shí)間予以說明。
Rothberg說，目前在客戶實(shí)驗(yàn)室和公司實(shí)驗(yàn)室的Proton系統(tǒng)上已經(jīng)完成了逾12000次運(yùn)行。
客戶反饋
客戶Joe Boland說，在AGBT舉行Ion Torrent研討會(huì)期間，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所實(shí)驗(yàn)室已采用六臺(tái)Proton完成了逾200次運(yùn)行，并對(duì)100多個(gè)外顯子組完成了測(cè)序。Joe Boland還說，其已采用Proton進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)，目前正在起草論文，對(duì)采用Proton進(jìn)行的外顯子組測(cè)序與采用HiSeq 2000進(jìn)行的外顯子組測(cè)序進(jìn)行比較。
Joe Boland解釋說，實(shí)驗(yàn)室每3.5小時(shí)平均可獲得約12千兆堿基數(shù)據(jù)，以20倍的覆蓋度覆蓋幾乎80%的外顯子組。與實(shí)驗(yàn)室去年11月通常產(chǎn)生的8千兆堿基數(shù)據(jù)相比，這已是一大改進(jìn)。Boland于去年11月（即最初安裝系統(tǒng)兩個(gè)月后）出席了美國(guó)人類遺傳學(xué)協(xié)會(huì)大會(huì)(IS 11/13/2012)。
目前，實(shí)驗(yàn)室每天能夠?qū)λ牡桨藗€(gè)外顯子組進(jìn)行測(cè)序，在各芯片上運(yùn)行一次外顯子組測(cè)序。測(cè)序運(yùn)行時(shí)間大概為三個(gè)半小時(shí)，而進(jìn)行分析需要額外花費(fèi)8到11個(gè)小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)室目前完成了宮頸癌的外顯子組測(cè)序研究。在110位女性中，選取24名采用Proton進(jìn)行外顯子組測(cè)序，其余采用Ion PGM的客制AmpliSeq面板進(jìn)行篩選，以篩查與宮頸癌有關(guān)的所有已知基因。
對(duì)外顯子組進(jìn)行處理，研究小組建立更大的AmpliSeq面板，以囊括經(jīng)由外顯子組測(cè)序確認(rèn)的新變種。
談及與HiSeq的比較時(shí)，Boland說兩個(gè)平臺(tái)“在檢測(cè)和calling SNPs時(shí)均運(yùn)行良好”，兩者的一致性高達(dá)99%，但是這兩個(gè)平臺(tái)仍存在著差異，“在插入缺失檢測(cè)方面存在問題”，這將在下一篇論文中進(jìn)行探討。
對(duì)于采用HiSeq進(jìn)行的外顯子組測(cè)序，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所實(shí)驗(yàn)室采用Nimblegen的SeqCap v3捕獲外顯子組，而采用Proton時(shí)其使用的是Life Technologies的TargetSeq v2。
此外，Boland還說，實(shí)驗(yàn)室期望采用Proton開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室采用系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序的首個(gè)轉(zhuǎn)錄組，Proton生成了5400萬讀數(shù)，由于實(shí)驗(yàn)室采用polyA 富集步驟（而非核糖體RNA損耗），核糖體RNA水平獲得“大幅度提升”。自此，研究小組轉(zhuǎn)向rRNA損耗。
實(shí)驗(yàn)室目前正在針對(duì)8個(gè)樣本開展研究，產(chǎn)生300千兆堿基數(shù)據(jù)，并對(duì)三家公司（Seven Bridges Genomics、Station X和Partek）的生物信息學(xué)管道進(jìn)行比較。
斯隆凱特林癌癥紀(jì)念中心基因組學(xué)核心實(shí)驗(yàn)室的負(fù)責(zé)人Agnes Viale正采用紐約基因組中心的四個(gè)Proton系統(tǒng)（該系統(tǒng)目前已安放在其實(shí)驗(yàn)室），主要用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
Viale還擁有一臺(tái)Roche 454 GS FLX、一臺(tái)454 GS Junior、兩臺(tái)Life Technologies的SOLiD 5500系統(tǒng)（其中一臺(tái)具有Wildfire升級(jí)）、兩臺(tái)Illumina HiSeqs（其中一臺(tái)已升級(jí)到2500版）、一臺(tái)Illumina MiSeq和一臺(tái)PGM。
Viale在基因組生物學(xué)和技術(shù)革新大會(huì)上介紹說。四臺(tái)Proton于去年9月安裝在其實(shí)驗(yàn)室，12月開始首次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，
人類腫瘤和發(fā)病機(jī)制項(xiàng)目的腫瘤學(xué)家和研究人員Ross Levine計(jì)劃開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，以對(duì)具有FLT3/TET2突變的急性骨髓性白血病在小鼠模型內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行研究。雙重變異之前均產(chǎn)生了不良預(yù)后，實(shí)驗(yàn)室希望設(shè)計(jì)出一種小鼠模型，該模型可用于測(cè)試藥物并獲得生物洞察力。
Levine的研究小組希望快速完成用于研究的12個(gè)轉(zhuǎn)錄組，因此Viale建議采用最新安裝的Proton系統(tǒng)。
從100毫微克總RNA中構(gòu)建基因文庫(kù)。在適配器連接、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增以及大小選擇后，接下來將進(jìn)行的是rRNA損耗。之后，對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序。
Viale說，從樣本制備到測(cè)序的整個(gè)工作流三天內(nèi)可以完成。如果基因文庫(kù)于星期一上午9點(diǎn)開始，則單觸連接可于星期二下午4點(diǎn)開始，并可徹夜運(yùn)行。可在星期三上午進(jìn)行磁珠富集，大概中午開始測(cè)序，下午4點(diǎn)可以獲得原始數(shù)據(jù)，Viale說。
這12個(gè)樣本平均每個(gè)樣本通過104堿基讀數(shù)產(chǎn)生6200萬讀數(shù)，約為
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