期刊：Experimental & Molecular Medicine
影響因子：12.9
主要技術(shù)：scRNA-seq、Visum
摘要
食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）患者常因淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而面臨嚴(yán)峻預(yù)后。然而，關(guān)于ESCC轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的細(xì)胞和分子特性的全面理解仍然難以實(shí)現(xiàn)。在這項(xiàng)涉及12名轉(zhuǎn)移性ESCC患者的研究中，我們采用了單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）和多重免疫組化學(xué)（mIHC）技術(shù)，探索原發(fā)腫瘤樣本、鄰近組織、轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的空間和分子屬性。對161333個細(xì)胞的分析顯示，上皮細(xì)胞中有特定亞簇在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中顯著富集，表明具有促轉(zhuǎn)移特性。此外，腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞，包括MMP3+IL24+成纖維細(xì)胞、APLN+內(nèi)皮細(xì)胞和CXCL12+周細(xì)胞，也被認(rèn)為通過血管生成、膠原蛋白生成和炎癥反應(yīng)參與ESCC轉(zhuǎn)移。處于循環(huán)狀態(tài)的CD8+ T細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中尤為常見，表明其在促進(jìn)轉(zhuǎn)移中具有潛在作用。我們識別出不同的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)和特定的配體-受體通路。我們的發(fā)現(xiàn)通過空間轉(zhuǎn)錄組圖譜和mIHC得到了驗(yàn)證。本研究加深了我們對ESCC患者轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)細(xì)胞和分子層面的理解，為這些患者提供潛在的新治療策略見解。
主要技術(shù)
scRNA-seq、Visum
研究結(jié)果
1.通過scRNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示的ESCC表征
為全面闡明ESCC的細(xì)胞特性，我們對12名ESCC患者通過手術(shù)獲得的29個樣本進(jìn)行了scRNA-seq分析，包括12個腫瘤樣本、6個鄰近正常組織、4個轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和7個非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（圖1a）。共計對161333個高質(zhì)量細(xì)胞進(jìn)行了以下分析，其中61928個細(xì)胞來自腫瘤樣本，29518個來自鄰近正常組織的細(xì)胞，49966個來自淋巴結(jié)的細(xì)胞，以及19921個來自轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的細(xì)胞。根據(jù)已知標(biāo)志物鑒定了12種主要細(xì)胞類型（圖1b，c），包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。此外，我們的結(jié)果顯示，T細(xì)胞的分?jǐn)?shù)和B細(xì)胞在淋巴結(jié)中的比例遠(yuǎn)高于其他樣本，而轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中上皮細(xì)胞的比例最高（圖1d）。此外，利用一名轉(zhuǎn)移性ESCC患者的腫瘤樣本，揭示了ESCC的空間轉(zhuǎn)錄組特征，并在ST切片上標(biāo)注了每種主要細(xì)胞類型（圖1e）?？傮w而言，我們揭示了ESCC組織的細(xì)胞組成和空間特征，便于后續(xù)對轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞亞群的分析。
圖1
2.轉(zhuǎn)移性ESCC中具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移特征的上皮細(xì)胞
從腫瘤樣本、正常組織和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中識別出16416個惡性上皮細(xì)胞。共分類了3個上皮細(xì)胞亞簇，其中大多數(shù)起源于腫瘤樣本和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（圖2a，b）。大多數(shù)來自鄰近組織的上皮細(xì)胞為ME1亞簇，表明ME1亞簇的惡性潛力相對較低。ME2和 ME3亞簇主要從腫瘤樣本和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中采集，表明ME2和ME3亞簇可能具有較高轉(zhuǎn)移潛力。與鄰近組織獲得的上皮細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)獲得的上皮細(xì)胞CNV評分遠(yuǎn)高于此（圖2c）。每個亞簇的關(guān)鍵標(biāo)記基因如圖2d。此外，我們的發(fā)現(xiàn)顯示ME1亞群在三個亞群中惡性評分最低，非惡性分?jǐn)?shù)最高，這意味著ME1亞群的惡性潛能較低（圖2f）。我們評估了這些基因在上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，這些基因來自ESCC、鄰近組織和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，隨后選擇了在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中高度表達(dá)的基因作為促轉(zhuǎn)移基因（圖2e）。與轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的功能相比，顯示原發(fā)腫瘤的藥物代謝和耐藥性高度富集（圖2g）。在組織學(xué)層面，腫瘤區(qū)域在H&E圖像和ST特征圖中確定（圖2h）。根據(jù)促轉(zhuǎn)移特征，識別出特定的轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域，并在轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域周圍發(fā)現(xiàn)血管，表明新血管的招募可能是ESCC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。mIHC圖像顯示，上皮細(xì)胞的標(biāo)記基因（EPCAM、DSP和TXNRD1）在腫瘤區(qū)域，尤其是轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域高度表達(dá)（圖2i）。通過空間分析和mIHC驗(yàn)證了所選基因，上述結(jié)果顯示TXNRD1在促轉(zhuǎn)移區(qū)域高度表達(dá)。
圖2
3.mCAF1（MMP3+IL24+）通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)血管新生，促進(jìn)了ESCC轉(zhuǎn)移
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在塑造癌癥進(jìn)展和促進(jìn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮顯著作用。隨后，我們研究了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的亞群。根據(jù)先前的研究，我們將14248個CAFs歸為兩個主要亞群：iCAF和mCAF（圖3a）。iCAF亞簇主要富含生長因子，包括WNT和NF-kB通路（SFRP1和NFKBIZ），以及一些趨化因子標(biāo)記（CXCL1和CCL2），而mCAF亞簇則顯著積累了POSTN基因（圖3b）。隨后共識別出四個mCAF亞簇和六個iCAF亞簇，并發(fā)現(xiàn)不同亞簇的表達(dá)譜（圖3b）。
圖3
一些CAF亞簇同時富集于轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和原發(fā)腫瘤部位，如mCAF1（MMP3+IL24+）和mCAF4，表明這些亞簇可能在促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3c）。為進(jìn)一步探討這些CAF亞簇如何促進(jìn)轉(zhuǎn)移，我們發(fā)現(xiàn)mCAF1中MMP1和MMP3的表達(dá)水平顯著高于其他亞群（圖3d）。MMP3可能降解基底膜和ECM，為腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移提供條件。與MMP3的功能類似，p53的功能障礙可能提高M(jìn)MP1表達(dá)，進(jìn)而加劇肺腺癌的轉(zhuǎn)移。CXCL8的表達(dá)水平在mCAF1中也明顯高于其他亞簇。此外，我們發(fā)現(xiàn)抗血管生成基因（如HIF1A）和缺氧相關(guān)基因（如ADM）在mCAF1中表達(dá)較高（圖3e）。功能分析還顯示血管生成主要富含mCAF1（圖3f）。通過ST和mIHC驗(yàn)證了mCAF1區(qū)域及相關(guān)標(biāo)記基因，樣本取自轉(zhuǎn)移性ESCC，顯示mCAF1在TME的間質(zhì)區(qū)中富集（圖3g，h）。mCAF1亞簇也包圍了ST特征圖中的促轉(zhuǎn)移區(qū)域，表明mCAF1亞簇參與了ESCC轉(zhuǎn)移（圖3g）。本研究提出，mCAF1促進(jìn)的腫瘤微環(huán)境中ECM和血管生成的降解可能促成ESCC轉(zhuǎn)移。
4.SOX4和SOX11通過再生血管生成和膠原蛋白生成驅(qū)動APLN+內(nèi)皮細(xì)胞趨向促進(jìn)轉(zhuǎn)移表型
內(nèi)皮細(xì)胞是ECM的重要組成部分。3325個內(nèi)皮細(xì)胞分為4個簇，包括1個動脈內(nèi)皮細(xì)胞（AEC）亞簇、2個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）亞簇、4個血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）亞簇和1個淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）亞簇（圖4a）。我們的發(fā)現(xiàn)顯示，CEC亞簇中積累了與毛細(xì)血管功能（如RGCC和PLVAP）相關(guān)的基因（圖4b）。我們發(fā)現(xiàn)CEC亞群，尤其是CEC2，在原發(fā)腫瘤樣本和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中占優(yōu)，表明CEC2可能在ESCC轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用（圖4c）。
為了進(jìn)一步探討CEC2在轉(zhuǎn)移性ESCC中的作用，我們發(fā)現(xiàn)APLN和APLNR在CEC2（又稱APLN+內(nèi)皮細(xì)胞）中表達(dá)較高（圖4d）。APLN通常被視為與再生血管生成相關(guān)的重要生物標(biāo)志物，可能使內(nèi)皮細(xì)胞從成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)。此外，COL4A1和COL4A2在CEC亞簇中表達(dá)較高，尤其是在APLN+內(nèi)皮細(xì)胞中，表明這些亞簇在生成膠原蛋白中起著重要作用（圖4c）。膠原蛋白粘連是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制，這可能是APLN+內(nèi)皮細(xì)胞的潛在功能。此外，COL4A1還可能激活FAK-Src信號通路，進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。
隨后，我們進(jìn)行了SCENIC檢測APLN+內(nèi)皮細(xì)胞的上游轉(zhuǎn)錄因子，這些因子可能驅(qū)動APLN+內(nèi)皮細(xì)胞形成促轉(zhuǎn)移表型。SOX4和SOX11是APLN+內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)最顯著的轉(zhuǎn)錄因子之一（圖4f）。SOX4主要與膠原蛋白生成相關(guān)（如CXCR4、COL4A1和COL4A2），而SOX11調(diào)控與再生血管生成相關(guān)的基因（RGCC和APLN），進(jìn)一步促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞向TME促轉(zhuǎn)移表型的分化（圖4e）。通過mIHC圖驗(yàn)證了SOX4和SOX11的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4g）。此外，ST特征圖和解卷積分析結(jié)果顯示，APLN+內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞著腫瘤細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移區(qū)域，關(guān)鍵標(biāo)志基因的表達(dá)水平高度表達(dá)（圖4h-i）。mIHC圖被用來進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，顯示了ESCC中APLN+內(nèi)皮細(xì)胞的促轉(zhuǎn)移特性（圖4j）。
圖4
5.由平滑肌細(xì)胞形成的不連續(xù)血管和由PC1（CXCL12+）激活的炎癥反應(yīng)促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移
ESCC共將2191個細(xì)胞分為4個PC亞群和5個SMC亞群（圖5a）。大多數(shù)SMC亞簇在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的比例顯著減少，以PC1亞簇為主（圖5b）。SMCs是血管的關(guān)鍵組成部分，對于細(xì)胞周，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中PC1的比例顯著較高，暗示PC1亞簇在ESCC轉(zhuǎn)移中可能起作用（圖5c）。我們的發(fā)現(xiàn)顯示，CXCL12在PC1亞簇中表達(dá)較高，表明PC1可能激活轉(zhuǎn)移性ESCC中的特定炎癥通路（圖5c，d）。接著，我們識別出一些在PC1亞簇中顯著富集的通路，如IL-17信號通路、NF-κB信號通路和TNF信通路（圖5e）。使用ST特征圖、mIHC圖以及去卷積分析結(jié)果驗(yàn)證（圖5f–h）。
圖5
6.處于循環(huán)狀態(tài)的耗盡CD8+ T細(xì)胞可能是促轉(zhuǎn)移腫瘤微環(huán)境的重要組成部分
識別并分類了25816個CD8+ T細(xì)胞，分為六個亞簇（圖6a）。循環(huán)和耗盡的CD8+ T細(xì)胞在腫瘤樣本和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中相對豐富（圖6b）。我們將耗盡的CD8+ T細(xì)胞（CD8-TEX）分為兩個亞組，正常狀態(tài)的CD8+ T細(xì)胞（CXCL13+MKI67-）和循環(huán)狀態(tài)的CD8+ T細(xì)胞（CXCL13+MKI67+）（圖6c）。為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)移性ESCC中CD8+ T細(xì)胞的動態(tài)過渡過程，構(gòu)建了CD8+ T細(xì)胞狀態(tài)軌跡的擬時間圖譜。該軌跡以初生CD8+ T細(xì)胞（CD8-TN）、中央記憶CD8+ T細(xì)胞（CD8-TCM）、效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞（CD8-TEM）和效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞（CD8-TEMRA-TEFF）為CD8-TN與CD8-TEF之間的過渡狀態(tài)，最終達(dá)到循環(huán)-CD8-TEX的最終分化狀態(tài)（圖6d）。我們評估了每個CD8+ T細(xì)胞亞簇的耗盡水平，表明Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX得分最高（圖6e）。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）被認(rèn)為是癌癥治療的重要靶點(diǎn)，其中一些抑制性受體與T細(xì)胞耗盡相關(guān)。我們分析了5個ICI在不同CD8+ T細(xì)胞亞簇中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ICI在Cycling-CD8-TEX和CD8-TEX中表達(dá)較高，表明這兩個亞群的耗盡狀態(tài)（圖6f）。為了進(jìn)一步探討淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)特細(xì)胞相互作用，我們分析了正常和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的細(xì)胞間差異性通訊（圖6g）。與正常淋巴結(jié)相比，CD70-CD27和IL4-IL4R相互作用被顯著識別，這些相互作用可能激活CD8-TEX，進(jìn)而抑制腫瘤微環(huán)境。
圖6
結(jié)論
最新研究已證明ESCC免疫細(xì)胞的獨(dú)特特征。然而，尚未對ESCC中轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的單細(xì)胞層面微環(huán)境進(jìn)行深入研究。本研究中，我們使用了來自12名ESCC患者的29份樣本，包括腫瘤樣本、鄰近正常組織、轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，全面展示了轉(zhuǎn)移性ESCC在單細(xì)胞層面微環(huán)境中的細(xì)胞和分子特征。我們構(gòu)建了空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，并利用mIHC圖像進(jìn)一步探討ESCC轉(zhuǎn)移機(jī)制，驗(yàn)證了scRNA-seq的發(fā)現(xiàn)。scRNA-seq和ST的整合為開發(fā)和應(yīng)用轉(zhuǎn)移性ESCC的新治療策略奠定了基礎(chǔ)。
由于轉(zhuǎn)移仍是癌癥預(yù)防和治療中的重大挑戰(zhàn)，揭示TME的細(xì)胞和分子特性對于了解ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況至關(guān)重要。鑒于腫瘤細(xì)胞的固有異質(zhì)性，識別與轉(zhuǎn)移相關(guān)的獨(dú)特上皮細(xì)胞亞群的任務(wù)極具挑戰(zhàn)性。以往研究已識別出促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的特定上皮細(xì)胞亞簇，而在ESCC15,43中尚未發(fā)現(xiàn)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵亞簇。根據(jù)我們的研究，表現(xiàn)出促轉(zhuǎn)移特征的上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中數(shù)量豐富，這些淋巴結(jié)在ESCC中可能具有顯著的轉(zhuǎn)移潛力。我們的研究結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的耐藥性和藥物代謝功能并未顯著富集，表明這些上皮細(xì)胞亞群具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的特性。在組織學(xué)層面，我們已根據(jù)促轉(zhuǎn)移特征識別出轉(zhuǎn)移相關(guān)區(qū)域。值得注意的是，觀察到這些特定區(qū)域周圍有血管，表明新血管的招募可能在ESCC轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。
總之，我們提供了關(guān)于ESCC轉(zhuǎn)移中涉及的空間模式和不同細(xì)胞成分的獨(dú)特視角和關(guān)鍵信息。我們已鑒定出在ESCC中表現(xiàn)出促進(jìn)轉(zhuǎn)移特性的特定上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞可能成為轉(zhuǎn)移的主要起始因子。此外，需要更多關(guān)注間質(zhì)細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和周圍細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兛赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)血管生成和影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成，在促進(jìn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，最近發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的多種免疫細(xì)胞積極促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移。最近發(fā)現(xiàn)的促轉(zhuǎn)移細(xì)胞成分以及腫瘤微環(huán)境中獨(dú)特的細(xì)胞間通訊，將對開發(fā)轉(zhuǎn)移性ESCC的有效治療策略至關(guān)重要。
參考文獻(xiàn)：
Guo W, Zhou B, Dou L, Guo L, Li Y, Qin J, Wang Z, Huai Q, Xue X, Li Y, Ying J, Xue Q, Gao S, He J. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics of esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastases. Exp Mol Med. 2025 Feb;57(1):59-71. doi: 10.1038/s12276-024-01369-x. Epub 2025 Jan 1. PMID: 39741182; PMCID: PMC11799171.