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規(guī)格：100 管/96?樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 ?個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：
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微量法
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類酰基轉(zhuǎn)移酶。可逆地催化從酰基輔酶A 將酰基轉(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應(yīng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用。
測(cè)定原理：
基于肉堿和脂酰輔酶A 在丙二酰輔酶A 存在與否的條件下，通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶A(COA-SH)， 與Ellman 試劑DN-TB 反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的TNB。通過其吸收峰值得變化（412nm），來(lái)定量分析CPT-1 的活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1??瓶，-20℃保存；試劑二：液體20mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑三：液體1.5mL×1 支，-20℃保存； 試劑四：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 試試劑五：粉劑×1?瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 稱取約0.1g 組織或收集500 萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL?試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿液于600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CPT-1（此步可選做）。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或
200W，超聲3 秒，間隔10 秒，重復(fù)30?次），用于線粒體CPT-1 測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）?在試劑五中加入1mL?無(wú)水乙醇，混勻，再加入22mL?試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）?或
25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）?在試劑六中加入 1mL?蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育5min； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（3）?在微量石英比色皿或96?孔板中加入10μL?樣本、220μL?試劑五和10μL?試劑六，混勻，記錄412nm?處20?秒時(shí)的初始吸光度A1?和2?分20?秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
CPT-1?活性計(jì)算：
a.?使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1）?按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB?定義為一個(gè)酶活力單位。CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)?÷T=880×ΔA÷Cpr 此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）?按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g ?組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W
（3）?按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。CPT- 1
（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA V 反總： 反應(yīng)體系總體積，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬(wàn)。
b.?使用96?孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1）?按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB?定義為一個(gè)酶活力單位。CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)?÷T=1760×ΔA÷Cpr 此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）?按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g ?組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=355.6×ΔA÷W
（3）?按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。CPT-1（nmol/min/10
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