面對新冠病毒疫情的持續(xù)爆發(fā)，急需開發(fā)安全有效的抗病毒藥物。單克隆抗體藥物是醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展規(guī)模最大、增長最快的領(lǐng)域。在SARS和MERS疫情期間，就有一些中和抗體被開發(fā)，現(xiàn)在也有多種抗體藥物已用于新冠病毒的臨床研究。但由于抗體藥物臨床使用中的費(fèi)時費(fèi)力、難以運(yùn)送到特定組織發(fā)揮作用，而限制了其應(yīng)用，因此有科學(xué)家就找到了納米抗體這一有潛力的替代方案。
納米抗體是利用駱駝類免疫球蛋白制備的單域抗體，也稱為VHH。他們是分子量為12-15 kDa的最小天然抗原結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域。不同于常規(guī)的抗體，只有重鏈沒有輕鏈，即僅有單個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。但是納米抗體的抗原親和力和特異性不受影響，并且具有分子量低、穩(wěn)定性高、易表達(dá)、不易出現(xiàn)空間位阻等優(yōu)勢。由于納米抗體的尺寸小、生物物理學(xué)特性好，可以通過吸入方式給藥，其特別適用于治療呼吸系統(tǒng)疾病。
接下來，我們將對義翹神州新冠病毒科研試劑在納米抗體研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述分析。
Cell：發(fā)現(xiàn)能夠中和新冠病毒、SARS、MERS的納米抗體
在這篇新冠病毒抗體研發(fā)的重要文章中，研究人員利用SARS和MERS病毒S蛋白對大羊駝（llamas）進(jìn)行免疫，通過噬菌體展示技術(shù)，獲得針對5種靶向SARS病毒S蛋白的納米抗體和7種靶向MERS病毒S蛋白的納米抗體。其中各有近一半對相應(yīng)S蛋白具有高親和力。體外構(gòu)建SARS、MERS假病毒進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些納米抗體具有較好的中和活性。
考慮到納米抗體的優(yōu)勢，研究人員就想了解其是否對新冠病毒具有中和特性呢？研究人員通過購自義翹神州的新冠病毒RBD蛋白及其他相關(guān)蛋白進(jìn)行了一系列的研究。通過SPR測試SARS VHH-72與新冠病毒RBD和亞域1（RBD-SD1）的交叉反應(yīng)性，結(jié)果顯示解離常數(shù)增加。通過基于生物層干涉法（BLI）的檢測，發(fā)現(xiàn)納米抗體可通過直接干擾宿主細(xì)胞受體結(jié)合來中和病毒靶點(diǎn)蛋白。并且通過與人IgG Fc融合，納米抗體可以交叉中和新冠病毒S假病毒。這種融合的VHH-Fc可以通過CHO細(xì)胞系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)，為VHHs中和致病性β冠狀病毒提供了分子基礎(chǔ)，也為COVID-19或其他冠狀病毒提供了潛在的治療策略。
Cell子刊：鑒定出靶向SARS-CoV-2的全人源納米抗體
復(fù)旦大學(xué)的研究人員建立了一種高效快速開發(fā)新冠病毒特異性的全人源納米抗體平臺，并且具有通用性。研究人員將全人源的重鏈可變區(qū)抗體骨架進(jìn)行篩選重構(gòu)，首次設(shè)計(jì)出基于天然胚系基因的的全人源抗體庫。
研究使用的新冠病毒相關(guān)蛋白購自義翹神州。首先用新冠病毒RBD蛋白（貨號：40592-V08B）和S1蛋白（貨號：40591-VO8H）作為抗原，從抗體庫篩選納米抗體。通過RBD蛋白為抗原生物親和篩選，獲得可顯著富集的18種納米抗體。其中n3010抗體與RBD結(jié)合緊密，但不與S1蛋白結(jié)合，說明抗體識別的表位在整個S1蛋白中處于隱藏狀態(tài)。以S1蛋白為抗原獲得與RBD完全不同的抗體圖譜，大部分都能與S1和RBD結(jié)合，只有n3072與S1強(qiáng)力結(jié)合，但不與RBD結(jié)合。通過對靶向S1的納米抗體中和活性研究發(fā)現(xiàn)，n3086和n3113顯示出中等強(qiáng)度的中和活性，能夠抑制新冠病毒假病毒的侵染，在活病毒中檢測到明顯的細(xì)胞病變。并且n3086和n3130靶向病毒S蛋白三聚體的一類特殊隱藏表位，首次揭示了RBD獨(dú)特的免疫原性以及靶向S蛋白隱藏表位的中和抗體。
bioRxiv：獲得靶向RBD的新型納米抗體
研究以新冠病毒的RBD蛋白為靶點(diǎn)，篩選人源化單域納米抗體。這些抗體符合結(jié)合動力學(xué)，平衡解離常數(shù)Kd為0.7-33nM，具有假病毒和活病毒中和活性。通過競爭性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，納米抗體能夠完全或顯著抑制新冠病毒RBD與受體ACE2之間的結(jié)合。人源IgG1 Fc與納米抗體融合，能夠使其中和活性提高數(shù)十倍。研究結(jié)果揭示了以新冠病毒RBD為靶點(diǎn)的新型納米抗體，為抗體藥的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文中寫到“Recombinant proteins were purchased from Sino Biological (Beijing, China) for SARS-CoV-2 RBD (40592-V05H, 40592-V08B), SARS-CoV-2 spike (40589-V08B1), SARS-CoV spike (40150-V08B1), ACE2 (10108-H08H).”對于這些購自義翹神州的新冠病毒試劑，科研人員用于不同的實(shí)驗(yàn)研究。
首先對新冠病毒RBD蛋白進(jìn)行處理，在高度多樣化的人源納米抗體合成文庫中進(jìn)行靶向RBD抗體的篩選，獲得陽性克隆經(jīng)過測序后進(jìn)行蛋白表達(dá)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。為了檢測獲得的納米抗體的結(jié)合親和力和競爭結(jié)合活性，將SARS-CoV-2 spike蛋白或SARS-CoV spike蛋白或ACE2蛋白分別固定在相應(yīng)的芯片上，對其穩(wěn)定結(jié)合模型或結(jié)合動力學(xué)進(jìn)行分析。
bioRxiv：介紹一種制備新冠病毒納米抗體的方法
研究人員選擇3種靶蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別是實(shí)驗(yàn)室合成的新冠病毒RBD（Pro330-Gly526殘基與Venus YFP融合而成，RBD-vYFP）、購自義翹神州的RBD蛋白（Arg519-Phe541融合小鼠IgG1 Fc，RBD-Fc，貨號：40592-V05H）以及Spike全長胞外域蛋白（殘基Val16-Pro1213，ECD，貨號：40589-V08B1）。首先將3種蛋白進(jìn)行生物素化處理，分裝成濃度為5μM的小等份。選擇RBD-vYFP和RBD-Fc作為結(jié)合劑進(jìn)行納米抗體的篩選，選擇RBD-vYFP和ECD蛋白構(gòu)建ELISA檢測體系。后續(xù)的親和力測定、ACE2競爭分析和假病毒中和檢測等實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中。
研究人員僅用12個工作日就快速的從組合文庫中篩選出完整的抗體，利用核糖體和噬菌體展示技術(shù)，鑒定了63個特異性的抗RBD的納米抗體，也具有與新冠病毒S全長蛋白結(jié)合的特性。通過ELISA檢測，納米抗體能夠與RBD-vYFP和ECD蛋白結(jié)合，不與對照蛋白MBP結(jié)合，說明納米抗體具有高特異性。研究人員認(rèn)為這些納米抗體可以開發(fā)成一種吸入性藥物，成為方便預(yù)防或治療COVID-19的藥物。
義翹神州于1月22日全球首發(fā)新冠病毒重要靶點(diǎn)受體結(jié)合域蛋白S-RBD，目前已陸續(xù)上線一系列新冠病毒相關(guān)研究試劑，包括重組蛋白、抗體、ELISA檢測試劑盒、蛋白芯片、基因等，全面覆蓋新冠病毒重要靶點(diǎn)抗原分子Spike（S1、S2、RBD、S全長胞外域）及其他（Nucleocapsid、 Plpro、3CLpro、Envelope、Membrane）。相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)助力多篇新冠病毒研究文章，比如靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)、中和抗體篩選、免疫效價(jià)評估等研究領(lǐng)域。
參考文獻(xiàn)：
Daniel Wrapp, et al. Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell.
Yanling Wu, et al. Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host & Microbe.
Xiaojing Chi, et al. Humanized Single Domain Antibodies Neutralize SARS-CoV-2 by Targeting Spike Receptor Binding Domain. bioRxiv.
Justin D. Walter, et al. Synthetic nanobodies targeting the SARS-CoV-2 receptor binding domain. bioRxiv.