? ? ? ?腫瘤內存在著高度的異質性，這種異質性表現在多個層面，比如腫瘤內既有致瘤細胞亞群，也有非致瘤細胞亞群；有空間異質性（相同腫瘤不同區(qū)域不同）與時間異質性（原發(fā)性腫瘤與繼發(fā)性腫瘤不同）之分；腫瘤間異質性和腫瘤內異質性，也就是不同腫瘤的細胞之間的基因與表型不同以及相同腫瘤的不同細胞之間的基因與表型也不同[1]。而腫瘤異質性的存在使得腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預后等各方面產生差異。
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圖1 腫瘤的時空異質性[1]
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? ? ? ?尤其隨著治療的不斷進行，藥物壓力以及腫瘤克隆演化會導致腫瘤內主克隆、亞克隆的不斷變更，以及新的變異克隆的出現和發(fā)展，這就是腫瘤的時空異質性。
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? ? ? ?為了克服癌癥時空的異質性，更清楚腫瘤在治療中的分子狀態(tài)，可以在各個時間節(jié)點進行患者的腫瘤大量單細胞轉錄組測序，以獲取全面的信息。
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? ? ? ?利用ChromiumTM Single Cell 3’Solution技術，可為腫瘤研究人員提供群體腫瘤細胞基因表達信息，區(qū)分腫瘤亞群細胞異質性，可進行腫瘤微環(huán)境研究、腫瘤細胞分群、新類型細胞的發(fā)現以及腫瘤細胞亞群與正常組織細胞亞群的差異，從而進一步研究腫瘤細胞克隆進化機制及相關新生物標記的鑒定等，為腫瘤的精準治療提供更為精細可靠的依據。
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? ? ? ?翻閱高分的雜志和腫瘤的年會，發(fā)現多種腫瘤不同方向的研究都用到了群體單細胞測序。如：單細胞測序在黑色素瘤、膠質瘤、胃癌等腫瘤的研究，幫助我們發(fā)現腫瘤亞型的差異、腫瘤細胞發(fā)展變化周期的差異等。下面小編就2篇高水平文章做詳細的解讀，供各位科研達人參考。
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Dissecting the multicellular ecosystem of metastaticmelanoma by
single-cell RNA-seq[2]
期刊：《Science》 發(fā)表時間：2016.4 影響因子：37.205 發(fā)表單位：哈佛醫(yī)學院
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? ? ? ??如今在整個生物領域中正被用來研究一個共同的問題：如何研究異質細胞群體中的細胞多樣性。這種多樣性能夠對細胞存活和增殖、對藥物療法和干預作出的反應以及很多其他的生物過程產生深刻影響。大規(guī)模單細胞轉錄組測序可用來研究黑色素瘤組織多樣性的復雜細胞微環(huán)境。
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? 通過流式分選了來自于19個患者的4,645細胞進行單細胞轉錄組測序；每個細胞15萬Reads數。
? 熒光免疫組化分析。
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? 單細胞轉錄譜區(qū)分惡性細胞和非惡性細胞的狀態(tài)
? ? ? ??通過CNV分析確定為惡性的細胞，然后根據其基因表達情況進行了TSNE降維分析，惡性細胞分為6個亞型（圖1），表明了腫瘤的異質性。而非惡性細胞則相反，主要是通過細胞類型進行了區(qū)分，比如T細胞、B細胞、巨噬細胞、內皮細胞、癌相關成纖維細胞（CAFs）和NK細胞（圖2）。
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圖2 惡性細胞和非惡性細胞分群結果
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? 惡性細胞的分析揭示了細胞周期的異質性
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? ? ? ?我們使用G1或S／M期的標志性基因來分析惡性細胞的不同亞群（圖3），該分析揭示了在腫瘤組織中，循環(huán)的細胞所占的比例平均為13.5%；也區(qū)分低循環(huán)狀態(tài)的細胞和高循環(huán)狀態(tài)的細胞，比如Mel79處于低循環(huán)、而Mel78則處于高循環(huán)狀態(tài)的腫瘤。KDM5B基因的表達與非循環(huán)狀態(tài)的腫瘤有高度相關性，它在小鼠模型中編碼H3K4組蛋白去甲基酶，這個酶與低循環(huán)相關，同時也有類似于黑色素瘤干細胞的耐藥性的特征。
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圖3 細胞所處循環(huán)狀態(tài)展示圖
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? 非惡性細胞以及他們在黑色素瘤微環(huán)境中的相互作用
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? ? ? ?各種各樣的非惡性細胞組成了腫瘤的微環(huán)境，微環(huán)境的組成對腫瘤的發(fā)生和調節(jié)有重要影響。通過單細胞測序的數據區(qū)分了微環(huán)境中不同細胞的類型（圖4），包括了T細胞、B細胞、巨噬細胞、內皮細胞和腫瘤相關的成纖維細胞（CAFs），并通過特征標簽揭示了這些細胞在微環(huán)境中的相對豐富程度。
? ? ? ?接下來我們分析細胞在腫瘤微環(huán)境中的作用關系，有很多新的發(fā)現，比如一群在CAF細胞中特征表達的基因與T細胞的浸潤有高度相關性（圖4B）。
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圖4 大量黑色素瘤細胞之間的數據拆分解揭示了細胞與細胞間的相互作用
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? 腫瘤浸潤性T淋巴細胞的多樣性及其功能狀態(tài)
? ? ? ?腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），尤其是CD8 + T細胞是免疫監(jiān)視的主要決定因素。單細胞測序分析來推斷各種類型T細胞的功能，從而有助于研究對免疫檢查抑制劑的腫瘤反應和抵抗（圖5）：
通過特征性標記定義了T細胞的主要亞群，比如CD4+,Tregs，CD8+等（圖4A）。然后通過耗竭基因分析了細胞的耗竭狀態(tài)，并通過免疫組化驗證（圖5B和5C）。
? ? ? ?最后分析了細胞毒T細胞中耗竭T細胞的特征表達狀態(tài)，以及高耗竭和低耗竭細胞的基因表達情況（圖5D、E、F），并進行了TCR分析（圖5G和H）。
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圖5 T細胞耗竭特征基因的激活依賴和非激活依賴變異
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? ? ? ?通過對黑色素瘤開展的大規(guī)模單細胞轉錄組測序，系統(tǒng)研究了腫瘤內的不同細胞亞群的組成、細胞亞群的功能以及腫瘤的微環(huán)境，為精準免疫治療提供了參考。
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Decouplinggenetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant
gliomas by single-cell RNA-seq[3]
期刊：Science，2017.3 影響因子：37.205 發(fā)表單位：馬薩諸塞州總醫(yī)院、哈佛醫(yī)學院
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? ? ? ?腫瘤細胞的基因型和表達程序與細胞的表型、腫瘤微環(huán)境的作用、腫瘤的特質、演變和治療抵抗有關。最近幾年，腫瘤的基因組圖譜之類的研究繪制了腫瘤的遺傳景觀、幾千個腫瘤的表達形態(tài)、識別了驅動突變、并根據特定的轉錄圖譜區(qū)分不同的亞型。但是腫瘤的遺傳狀態(tài)可以更為精確的進行研究，而整塊組織的基因表達提供的信息是有限的，因為腫瘤程序的表達決定因素、微環(huán)境的影響以及腫瘤內基因的異質性都被整體平均了。而單細胞轉錄組測序可以解決這些問題，但是同時也帶來了更多的花費和更多的工作量，比如需要更多的時間從新鮮的腫瘤樣品當中獲得單個細胞，尤其是一些罕見腫瘤。
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? ? ? ?? 10個IDH-A患者，流式分選腫瘤細胞，然后進行單細胞RNA-seq。6個IDH-O患者，流式分選腫瘤細胞，進行單細胞RNA-seq。
? ? ? ?? 分析了從TCGA數據庫下載的76個IDH-O91個IDH-A膠質瘤大量細胞的數據，有550個差異表達的基因。并對比了單細胞測序的結果與大量細胞測序的結果進行比較。
? ? ? ?? DNA、RNA原位雜交。
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? 分析IDH突變的膠質瘤標本單細胞RNA-Seq與大量細胞RNA-seq結果的差異基于細胞分群的方法：
1> 基因表達聚類分析，細胞分為膠質瘤細胞、免疫細胞和少突膠質細胞。
2> 由于膠質瘤細胞常伴有大的染色體變異，我們使用每個細胞在大的染色體區(qū)域基因表達的數據來評估CNVs，然后通過外顯子測序和DNA FISH來驗證CNV。使用基因表達和CNV來分類細胞的結果是一致的，一共定義了5097個惡性細胞。
接下來將單細胞測序的數據與ATCG下載的大量細胞RNA-seq的數據進行比較，尋找兩種腫瘤亞群基因表達的差異，并分析亞群特征性基因（圖6）。
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圖6 IDH-A和IDH-O因為腫瘤微環(huán)境和遺傳學導致的基因表達的差異
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? ? ? ?其中一半的基因在單細胞測序中沒有差異，在大量細胞測序有差異，表明非惡性細胞導致的差異基因占了一半。免疫基因和神經基因作為非惡性細胞的基因就是一些干擾因素。
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? IDH-A與IDH-O惡性細胞基因表達的差異主要源于基因組的問題。
基于轉錄組的結果主要是有4類基因組的變異引起的，分別是1p/19q、CIC激活的基因、CIC抑制的基因和P53的靶基因（圖7）。
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圖7 不同腫瘤亞型的特征基因均有以上4類遺傳學影響導致
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? 單細胞測序顯示IDH-A和IDH-O共享膠質細胞譜系
之前研究認為IDH-A和IDH-O分別以星狀膠質細胞和少突膠質細胞為主。通過特征基因和PCA分析IDH-A和IDH-O膠質細胞的差異基因是很少的（圖8），他們的區(qū)別主要是因為遺傳學和腫瘤微環(huán)境的差異，而并不是膠質細胞的差異。
圖8 IDH-A和IDH-O共享膠質細胞系
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? 未分化的膠質瘤細胞與增值和干性相關
接下來分析了IDH-A和IDH-O中的未分化細胞，發(fā)現在2個亞群基因表達的高度相似性，均具有干性的功能，并通過熒光雜交進行驗證（圖9）。
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圖9 IDH-A和IDH-O的分化細胞主要是循環(huán)細胞和假定的干細胞
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? 腫瘤微環(huán)境中膠質細胞和巨噬細胞的平衡
最后，我們采用PCA分析了小膠質細胞/巨噬細胞細胞的多樣性，發(fā)現了膠質瘤中膠質細胞和巨噬細胞的表達程序，其中巨噬細胞的程序與腫瘤的臨床分級和血管增加相關。腫瘤中的小膠質細胞/巨噬細胞轉錄程序具有連續(xù)性（而不是一個雙峰分布），提示細胞狀態(tài)的可塑性。并找到了腫瘤中浸潤更多的小膠質細胞/巨噬細胞的特征基因（圖10）。
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圖10 IDH-突變膠質瘤的膠質細胞和巨噬細胞的平衡
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? ? ? ?我們通過單細胞轉錄組測序的方法分析了腫瘤細胞基因型、表型和微環(huán)境組成，重新定義人類的IDH突變的膠質瘤細胞組成（圖11），為解釋不同腫瘤表型的區(qū)別提供了一個通用的研究思路，其研究結果在疾病管理及治療方面有重要參考價值。
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地 址： 北京市亦莊經濟技術開發(fā)區(qū)科創(chuàng)六街88號，亦莊生物醫(yī)藥園C座 聯系人： 市場部 電 話： 18600397163 傳 真： Email：zhiyuanjing@capitalbiotech.com
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