荷蘭奈梅亨市的內(nèi)梅亨大學醫(yī)學中心（Radboud University's Medical Center）目前正采用Life Technologies的Ion Torrent PGM開展遺傳性乳腺癌篩查測試，其計劃于3月向患者提供該項測試。
實驗室計劃在今年年底前提供PGM癌癥突變測試。
上周在佛羅里達州馬可島舉行的基因組生物學和技術(shù)進步會議上，內(nèi)梅亨大學中央基因分析實驗室的臨床分子遺傳學家和負責人Marcel Nelen在該會的Ion Torrent用戶會議上做了實驗室報告，他聲稱，對于BRCA 1/2測試，其將從Sanger測序轉(zhuǎn)向采用PGM的下一代測序。
荷蘭團隊與Jose Luis Costa的團隊在葡萄牙波爾圖大學（IPATIMUP）的分子病理學和免疫學研究所協(xié)同合作，共同開展此次測試。
多年來，內(nèi)梅亨團隊一直提供BRCA篩查測試，該測試采用了Sanger測序和多重連接依賴性探針擴增以測量外顯子缺失。Nelen表示，其希望設(shè)計開發(fā)出一種周轉(zhuǎn)時間更快、成本更低的測試。
對于Sanger測試，實驗室正在對15800個堿基序列進行分析，包括BRCA 1基因上的5600個堿基和BRCA 2基因上的10300個堿基。“這些基因具有豐富的多態(tài)性”， Nelen在報告中說，“突變是分散的，因而不存在熱點突變”。
通過采用Sanger測序，實驗室每個月對50至60個標本進行分析，周轉(zhuǎn)時間為3至5個星期。“盡管其高效快速，但是成本太高”， Nelen表示，扣除成本，所獲利潤已經(jīng)所剩無幾。
轉(zhuǎn)向采用PGM測序后，Nelen表示如果能縮減MLPA步驟，其希望能將目前的$3,000標價減少一半或以上，并將周轉(zhuǎn)時間減少至3到5天。
在考慮下一代基因測試時，Nelen說，其目標是希望在內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)的內(nèi)含子區(qū)域能100%覆蓋所有編碼外顯子以及至少10個堿基（乃至20個）。擴增子應(yīng)覆蓋所有外顯子并互相重疊。
實驗室目前擁有兩臺PGM，并設(shè)計出了一個訂制的AmpliSeq面板，以對BRCA 1和BRCA 2基因進行靶向分析。
經(jīng)與IPATIMUP協(xié)同努力，兩個實驗室對檢測進行驗證。最初，各實驗室對10個已知標本進行了測試，并對測試結(jié)果做了比較。隨后，各實驗室采用盲法對15個已知標本進行測試，即IPATIMUP實驗室對其已知的15個標本進行測試后，發(fā)送至內(nèi)梅亨實驗室供其測試，反之亦然。
測試結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)65個致病突變，各實驗室均未遺漏任一突變，Nelen進一步說明。此類突變包括缺失和插入、基因點突變、外顯子缺失以及均聚物延伸突變，Nelen說。
實驗室對標本進行了測試，該標本具有已知突變和之前未獲知的突變。
Nelen說，其目前正通過OncoNetwork Consortium與大量其他實驗室協(xié)同合作，致力于采用AmpliSeq技術(shù)設(shè)計開發(fā)癌癥面板。
該團隊正致力于開發(fā)一種適用于PGM的肺癌和結(jié)腸癌面板。
除內(nèi)梅亨大學醫(yī)學中心外，該團隊還包括OncoNetwork Consortium的其他成員，如意大利利阿諾的癌癥研究中心、瑞士Viollier制藥公司的遺傳學和分子生物學部門、英國的華威大學、法國的古斯塔夫-魯西研究所、法國的巴黎迪卡爾中心大學以及都柏林的圣詹姆斯醫(yī)院。
內(nèi)梅亨大學醫(yī)學中心同樣正致力于開展遺傳性嗜鉻細胞瘤測試。
肺癌和結(jié)腸癌面板含有90個擴增子，覆蓋22個基因中的熱點，需要的DNA總量為10毫微克，可從福爾馬林固定石蠟包埋組織中提取。
六個實驗室在OncoNetwork Consortium對155個標本進行測試后，完成了初步驗證。
第一階段：實驗室對從FFPE組織中提取的5個對照標本進行測序，其中兩個從KRAS細胞株中提取，一個從肺腺癌細胞株中提取，另外兩個為異種移植標本。 各實驗室分別為所有已知突變命名。
第二階段：各實驗室分別對從肺癌和結(jié)腸癌中提取的10個不同標本進行測序，進行測序的實驗室了解測序情況，其他小組不了解。各實驗室對標本進行測序后，分別將標本互相發(fā)送至其他實驗室，因此，六個實驗室總共對60個標本進行了測序。隨后，各實驗室分別為所有突變以及野生株和變異株命名。
第三階段：由于標本的“腫瘤內(nèi)容存在巨大差異”，這在給變異株命名時出現(xiàn)不少問題，Nelen表示。例如，由于沒有足夠的DNA，遺漏了一個標本中的突變。 盡管研究人員力圖通過Sanger測序?qū)ν蛔冞M行證實，但“這仍然無法獲得正確的序列”。
在第二次驗證時，實驗室最初對具有已知突變的8個FFPE標本進行了測試，確保該測試能檢測出突變。隨后，實驗室逐漸擴大測試規(guī)模，并對共計98個標本進行了測序。
“分子檢測應(yīng)具有可靠的性能、高度的準確性和臨床靈敏度，以便能檢測出熱點突變和功能失活突變，數(shù)日內(nèi)便可獲得檢測結(jié)果”， Nelen解釋說。
Nelen還說，實驗室將繼續(xù)對測試（包括引物設(shè)計和軟件）進行優(yōu)化和驗證。此外，還需在實驗室的LIMS系統(tǒng)中實施整個工作流程，Nelen補充說。
“我們的目標是采用截至年底提供的所有癌癥面板在3月份開展BRCA1/2測試。 實驗室目前正著手進行標本制備自動化和多重PCR測試，并希望能在年底完成。”