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【研究背景】
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? ? ? ? 過敏性哮chuan是一種頑固疾病，常因為炎癥引發氣道反應性增高，導致反復發作的chuan息、氣促、胸悶或ke sou等癥狀，多在夜間發生，可自行或通過治療而逆轉。導致過敏性哮chuan的因素很多，除遺傳因素外，哮chuan最重要的激發因素是吸入變應原，例如房塵螨，但是過敏性哮chuan是如何開始和產生的仍然是一個謎。之前研究表明2型先天性淋巴細胞（ILC2s）有助于粘膜穩態，同時會引發過敏性哮chuan。然而，ILC2s在轉錄上是異質性的，且對于ILC的功能狀態知之甚少，指導ILC2s促進體內平衡與炎癥的信號也并不清楚。隨著過敏性哮*患病率逐年增加，確定ILC2s對警報素（Alarmin）反應的分子途徑變得尤為重要，也是一個重要的研究領域。來自美國哈佛醫學院免疫病研究中心和布萊根婦女醫院的Kuchro領導的一個團隊使用10X單細胞轉錄組測序確定了常駐在肺部中的ILC的轉錄譜，發現了神經系統用來與免疫細胞進行溝通的一種基本的分子線索，它可能潛在的觸發過敏性肺部炎癥，從而導致哮chuan。
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【實驗流程】
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【研究結果】
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1、Alarmins（警報素）誘導ILC2s的異質性
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? ? ? ? 對24,187個細胞進行群體單細胞轉錄組測序（scRNA-seq），分析發現三種主要淋巴細胞狀態：ILC1s，ILC2s，ILC3s，三種不同的ILCs聚類為11個特征亞群。警報素IL-33和IL-25差異地調控先天性淋巴細胞狀態，但均激活ILC2s，高表達Il5，Klrg1和Arg1。無監督聚類分群結果顯示細胞分群與警報素刺激緊密相關：亞群⑦和⑨-?中大多數細胞由IL-33激活，亞群⑤和⑧中的細胞主要由IL-25激活。被Alarmin激活的ILCs比靜息ILC高1.5-2.5倍的基因表達，尤其是IL-33激活的ILC2s。
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圖1 通過scRNA-seq分析ILC的24,187個細胞(點)
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? ? ? ? 顯著差異表達的基因包含那些在ILCs生物學中具有已知作用的基因（圖2f）。Arg1，Il13和Klrg1在由IL-25激活的ILC2s亞群中高度表達。例如，亞群⑤和⑧，但是Ms4a4b僅在亞群⑧中表達。經流式細胞術驗證上述基因在蛋白質水平的表達，與單細胞測序結果一致。綜上，各ILC亞群存在不同的基因表達和功能狀態，IL-33和IL-25差異地調節這些狀態。
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圖2 代表差異表達基因（x軸）的集群（y軸）
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2、Nmur1被鑒定為ILC2特異性Marker
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? ? ? ? 使用基于全長的SMART-Seq2分析了PBS，IL-25-，IL-33處理的606個ILCs細胞，其基因表達譜，聚類，以及PCA或差異表達基因與10X單細胞轉錄組測序的圖譜高度一致；并將Nmur1鑒定為ILC2的特異性Marker（圖3，上）。
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圖3 scRNA-seq鑒定出ILC2特異性基因
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3、NMUR1在ILC2中特異性表達
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? ? ? ? NMUR1是神經肽NMU的受體，并且NMU-NMUR1信號調節炎癥反應，但該途徑在ILC中的作用未知。用房塵螨（HDM）提取物刺激產生氣道炎癥反應，Nmur1在ST2+ILC中高表達（圖3,下）。通過Nmur1–LacZ報告小鼠，經流式細胞術評估NMUR1蛋白表達，大約40％的ST2+ILCs表達NMUR1（圖4）。并且無論警報素如何刺激，NMUR1主要在ST2+ILC中表達，且與IL-25受體IL-17RB的表達無關。
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圖4 q-PCR和流式細胞術測定肺部神經肽受體NMUR1表達量
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4、神經肽NMU顯著擴大IL-25驅動的過敏性炎癥
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? ? ? ? 通過qPCR評估，在體外，NMU僅輕度上調Il5和Il13，但是當與IL-25聯合時，NMU顯著增加了Il5和Il13的mRNA和蛋白質表達，L-33和NMU的組合也增加IL-5和IL-13的表達，但程度低于IL-25與NMU結合。在體內，IL-25和NMU之間的協同作用更為顯著，IL-25與NMU聯合引起顯著的氣道反應（圖5）。其不增加肺組織中IL5或IL13的 mRNA的表達，而強烈地增加肺和BALF嗜酸粒細胞增多，并顯著增強組織病理學炎癥?？傊?，神經肽NMU將非病理劑量的IL-25轉化為病理劑量。為研究內源性神經肽NMU在ILCs中的作用，分析NMU缺陷型（Nmu-knockout）與野生型（WT）小鼠中的ILCs：過敏原攻擊Nmu-knockout小鼠后表達效應細胞因子的ILC2s頻率降低，表明NMU顯著促進ILC激活和效應功能—炎癥反應。
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圖5 NMU促進IL-25誘導的過敏性炎癥
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5、IL-25+NMU結合加重炎性ILC2s表達
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? ? ? ? Burkett說，“ke sou是由神經系統調節和控制的，我們的發現表明了NMU的作用：它能夠誘導平滑肌收縮和炎癥?！庇肞BS，NMU，IL-25和IL-25+NMU四種警報素激活ILCs，PBS（9,623個細胞），NMU（9,698個細胞），IL-25（6,849個細胞）和NMU+IL-25（9,372個細胞），單細胞轉錄組測序分析35,542個肺部駐留的ILC ，非監督聚類將它們分成11個簇（圖6）。其中五個簇幾乎完全由IL-25或IL-25+NMU活化的細胞組成。IL-25+NMU協同作用的一個機制是通過誘導不同亞群ILCs的增殖；用IL-25+NMU刺激的ILC比IL-25刺激的ILC的Ki67+ILC增加約兩倍，表明有顯著的增殖。IL-25+NMU協同作用的另一個機制是通過上調ILCs中IL-17RB表達；經流式細胞術評估IL-25+NMU 比單獨的IL-25顯著提高IL-17R+ILC 的頻率，并通過定量實時PCR驗證發現其上調肺中Il17rb的表達。
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圖6 IL-25和NMU協同活化炎性ILC2s
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6、HDM促進神經肽受體NMUR1激活ILC2
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? ? ? ? 表征NMUR1信號傳導對ILCs產生的影響，用HDM刺激野生型（WT）和Nmur1敲除(Nmur1-KO)小鼠，單細胞轉錄組測序分析21,895個單細胞，表征了ILC2s在WT和Nmur1-KO小鼠中的表達量（圖7）。在Nmur1-KO小鼠中，與PBS對照相比，HDM刺激后ILC2頻率顯著降低，在WT小鼠中也出現的這種趨勢，這與HDM刺激后Nmur1-KO小鼠中ST2+ILCs的降低頻率一致。基于用HDM和PBS處理的野生型ILC2s之間差異表達的基因，研究定義了炎性ILC2標簽（圖7c）。IL-25+NMU刺激的ILCs高度表征了這種炎癥信號，表明它識別與氣道炎癥模型無關的炎癥ILC2s（圖7d）。來自HDM處理的小鼠的ILC2s中的差異表達基因與用IL-25+NMU組合的小鼠的ILC2s中的那些顯著重疊。在HDM攻擊后，Nmur1-KO小鼠的ILC2s的平均炎性低于WT小鼠（圖7e）。
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圖7 NMUR1信號調節過敏原攻擊后的ILC應答
綜合起來，研究結果表征了一種新的導致免疫炎癥的神經-免疫通路，其加劇了體內粘膜過敏性炎癥。這些發現將為如何預防或治療過敏性哮*提供新的治療見解，可能導致人們開發出治療哮*的新療法。
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【博奧晶典10X單細胞轉錄組測序產品優勢】
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博奧晶典作為國內第一家引進10X Genomics平臺的公司，在國內率先開展上萬級通量的單細胞轉錄組測序服務。
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1、豐富的項目經驗：目前已經完成了300多個樣品、30種不同樣品類型的服務，覆蓋的物種和樣品類型包括人和小鼠的肝臟、肺臟、皮膚、心臟、腦、腎臟、血液、卵巢、神經，以及雞、斑馬魚、豬、水稻、擬南芥、油菜、白菜、橄欖等，擁有豐富的項目經驗。
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2、豐富的數據分析流程：在大規模單細胞轉錄組測序的數據挖掘上開發了很多新的流程，為單細胞轉錄組測序研究提供一站式服務。
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3、博奧晶典支持發表10X Genomics單細胞測序中國大陸首篇科研論文-PNAS（IF=9.423）。
