圖5. 四環(huán)素誘導(dǎo)型tetO-Cre（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018）
樞密科技可提供Cre-loxP重組酶系統(tǒng)的載體構(gòu)建服務(wù)及病毒包裝服務(wù)。
參考文獻(xiàn)：
1. 任榮榮, 王英偉. Cre/L oxp系統(tǒng)的應(yīng)用及進(jìn)展. 廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2008; 36（2）:78-80.
2. 孔維健, 常宇鑫, 昝春芳, 鄭爽, 楊小玉. 基于Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進(jìn)展. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2017; 21（12）:2208-2211.
3. Kesha Rana, Rachel A Davey, Jeffrey D Zajac. Human androgen deficiency: insights gained from androgen receptor knockout mouse models. Asian J Androl. 2014; 16(2): 169–177.
4. Hyeonhui Kim, Minki Kim, Sun-Kyoung Im, Sungsoon Fang. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018; 34(4): 147–159.
5. McLellan MA, Rosenthal NA, Pinto AR. Cre-loxP-Mediated Recombination: General Principles and Experimental Considerations. Curr Protoc Mouse Biol. 2017;7(1):1-12.
Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)載體構(gòu)建服務(wù)
Cre-LoxP系統(tǒng)
Cre-Loxp系統(tǒng)策略是進(jìn)行基因組定點(diǎn)突變的新途徑，可在DNA的特定位點(diǎn)上執(zhí)行敲除、插入、激活、倒轉(zhuǎn)及易位等。該系統(tǒng)在80年代被引入后，已被成功的應(yīng)用于酵母菌、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠身上。Cre-LoxP系統(tǒng)包括Cre重組酶和Loxp位點(diǎn)兩個(gè)部分。
Cre重組酶是整合酶家族的一員，1981年從大腸桿菌噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)，是最常用的位點(diǎn)特異性DNA重組酶。Cre基因有1029個(gè)堿基，Cre重組酶由343個(gè)氨基酸組成（約38kD），它不僅具有催化活性，而且跟限制酶相似，識(shí)別特異的DN A序列，如：loxP位點(diǎn)，引起重組。Cre重組酶有70% 的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。
loxP位點(diǎn)是Cre重組酶作用的特異性重組位點(diǎn)，兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和8 bp的間隔序列構(gòu)成，長(zhǎng)34 bp，具體序列如下：5’一ATAACTTCGTATA一GCATACAT一TATACGAAGTTAT一3’ / 3’一TATTGAAGCATAT 一CGTATGTA一ATATGCTTCAATA一5’。 兩個(gè)反向重復(fù)序列是Cre的識(shí)別序列，中間的間隔序列是重組發(fā)生的位置，同時(shí)也決定了loxP位點(diǎn)的方向，根據(jù)loxP序列的排列方向產(chǎn)生不同的重組結(jié)果。
圖1. Cre重組酶結(jié)合loxP的位點(diǎn)
Cre-loxP系統(tǒng)的原理
Cre-loxP系統(tǒng)存在以下幾種誘導(dǎo)重組的方式，這是基于Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)基因內(nèi)存在loxP位點(diǎn)且有Cre重組酶存在時(shí)，Cre重組酶便會(huì)與loxP位點(diǎn)兩端的反向重復(fù)序列區(qū)結(jié)合形成二聚體。此二聚體與其他loxP位點(diǎn)的二聚體結(jié)合，進(jìn)而形成四聚體。隨之，loxP位點(diǎn)之間的DNA序列被Cre重組酶切掉，切口通過DNA連接酶重新連接。DNA重組結(jié)果主要取決于loxP位點(diǎn)的方向及位置。
Cre重組酶介導(dǎo)的兩個(gè)loxP序列間的特異性重組根據(jù)序列位置和方向的不同分為三種 情況：①當(dāng)兩個(gè)loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相同時(shí)Cre重組酶能夠敲除兩個(gè)loxP序列間的DNA片段；②當(dāng)兩個(gè)loxP序列位于同一條DNA鏈且方向相反時(shí)，Cre重組酶能夠反轉(zhuǎn)兩個(gè)loxP序列間的DNA片段；③當(dāng)兩個(gè)loxP序列位于不同DNA鏈上時(shí)，Cre重組酶能夠介導(dǎo)loxP序列間DNA鏈的交換或染色體易位。Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過程。
圖2. Cre-loxP系統(tǒng)誘導(dǎo)重組的方式
Cre-loxP系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)
1. 高效性；
Cre重組酶與具有loxP位點(diǎn)的DNA片段形成復(fù)合物之后，可以快速引發(fā)DNA重組，不受靶基因大小和位置的影響。
2. 時(shí)空特異性；
可以特定時(shí)間實(shí)現(xiàn)體內(nèi)特定種類器官或組織中的基因敲除，避免了某些基因完全敲除所導(dǎo)致的胚胎致死效應(yīng)。
3. 應(yīng)用范圍廣。
真核及原核均適用，不同組織、不同生理?xiàng)l件下均可起作用。
Cre-loxP系統(tǒng)的應(yīng)用
一、條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建
1. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物依賴的基因敲除
一般應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)進(jìn)行基因操作時(shí)較為常見的形式是兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行雜交。方法為：
（1） 利用原核注射的方法獲得轉(zhuǎn)基因“Cre小鼠”。在Cre基因上游加入特異性啟動(dòng)子，利用啟動(dòng)子控制Cre重組酶的表達(dá)；
（2） 在胚胎干細(xì)胞（ES）中通過置換型載體進(jìn)行同源重組，向基因組靶位點(diǎn)引入選擇標(biāo)記基因，并在其兩側(cè)引入兩個(gè)同向排列的Loxp位點(diǎn)。兩條同源染色體都帶有 Loxp位點(diǎn)且引入的Loxp位點(diǎn)不能干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄。將該ES細(xì)胞打入假孕母鼠中，發(fā)育成“floxed小鼠”；
（3） “Cre小鼠”和“floxed小鼠”交配，Cre重組酶會(huì)在特定組織細(xì)胞表達(dá)，并切掉Loxp位點(diǎn)之間的靶基因和1個(gè)Loxp位點(diǎn)，從而達(dá)到靶基因的失活或敲除。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的缺點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高；
（2）區(qū)域特異性不高。
圖3. 使用cre-loxp系統(tǒng)獲得組織/細(xì)胞特異性基因敲除小鼠（Kesha Rana, et al., Asian J Androl, 2014）
1. 病毒依賴的基因敲除
由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的諸多缺點(diǎn)，現(xiàn)如今越來越多的科研工作者選擇新的方式來構(gòu)建條件性基因敲除小鼠，即病毒依賴的Cre-loxP重組系統(tǒng)，方法為：
（1） 通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物辦法獲得“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；
（2） 注射Cre病毒進(jìn)loxP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，或者注射loxP病毒到Cre轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，引入Cre或loxP元件。
病毒依賴的基因敲除的優(yōu)點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)周期短，成本小；
（2）區(qū)域特異性高。
二、基因插入
采用同源重組技術(shù)，在基因組上人工構(gòu)建兩個(gè)Loxp 位點(diǎn)，借助構(gòu)建的兩個(gè)Loxp 位點(diǎn)，把兩端帶有Loxp 位點(diǎn)的外源基因重組到基因組上，此種重組是雙向的，既可以把外源基因重組到小鼠基因組內(nèi)，也可把小鼠基因組內(nèi)源基因重組出來，這是定點(diǎn)整合的重要手段之一。
三、基因激活
利用Cre/Loxp系統(tǒng)不僅可對(duì)基因進(jìn)行敲除，還可對(duì)基因進(jìn)行特定激活，了解基因的正向效應(yīng)。在兩個(gè)同向Loxp位點(diǎn)之間加入終止信號(hào)，Loxp位點(diǎn)后加入靶基因，與Cre小鼠交配后，Cre重組酶切除終止信號(hào)及1個(gè)Loxp位點(diǎn)，其Loxp位點(diǎn)后面的靶基因便被“激活”表達(dá)。
四、基因倒轉(zhuǎn)、易位等
Cre-loxP系統(tǒng)的新進(jìn)展
1. 對(duì)Cre元件的改造：在Cre元件的C端接上雌激素受體（ER）的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，為了避免體內(nèi)雌激素的干擾，可對(duì)雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)做一定程度的改變，使其只能和某些雌激素衍生物相結(jié)合。目前使用最多的是Cre-ERT2突變體，融合蛋白Cre-ERT2不能入核，定位在胞漿內(nèi)，當(dāng)雌激素衍生物tamoxifen結(jié)合到Cre-ERT2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域后，蛋白才會(huì)通過構(gòu)象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別loxP位點(diǎn)并發(fā)生重組。通過控制tamoxifen的注射時(shí)間，就可以調(diào)控基因重組的時(shí)間特異性。
圖4. 他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018）
1. 對(duì)loxP元件的改造：loxP元件也可以在間隔區(qū)和回文序列進(jìn)行突變，不同的堿基選擇就造就了不同的lox位點(diǎn)，常見的有 lox2272、lox511、lox5171、loxN和loxP等。突變后的loxP序列和同樣突變的loxP序列匹配，才能被Cre重組酶識(shí)別和重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣就可以將不同的loxP序列組合用于控制多個(gè)基因，在Cre重組酶的作用下，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的重組。Brainbow技術(shù)就是根據(jù)loxP序列的改造而實(shí)現(xiàn)的。
2. 四環(huán)素誘導(dǎo)型tetO-Cre：將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)與Cre-loxP系統(tǒng)相結(jié)合，需要用兩種轉(zhuǎn)基因小鼠交配使用。一種是由四環(huán)素響應(yīng)啟動(dòng)子元件（TRE, 也叫 tetO）控制的Cre工具鼠（TRE-Cre, 也叫tetO-Cre）；另一種是由組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)四環(huán)