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慢性同種異體移植功能障礙（CAD）是導(dǎo)致同種異體腎移植損失的主要原因，其組織學(xué)特征為間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。通過(guò)snRNA-seq和轉(zhuǎn)錄組分析，確定了CAD腎同種異體移植中纖維化形成細(xì)胞的起源、功能異質(zhì)性和調(diào)控。從腎移植活檢中分離單個(gè)細(xì)胞核，并成功地分析了來(lái)自5名CAD腎移植受者的23,980個(gè)細(xì)胞核和來(lái)自3名正常同種異體移植功能患者的17,913個(gè)細(xì)胞核。揭示了兩種不同的CAD纖維化狀態(tài)；低和高細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)具有不同的腎細(xì)胞亞群，免疫細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)錄譜。大量細(xì)胞分析證實(shí)蛋白水平ECM沉積增加。近端腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閾p傷的混合腎小管（MT1）表型，由活化的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物組成，產(chǎn)生臨時(shí)的ECM，激活炎癥細(xì)胞，并作為纖維化的主要驅(qū)動(dòng)因素。高ECM狀態(tài)的MT1細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了復(fù)制性去分化和腎源性轉(zhuǎn)錄信號(hào)的修復(fù)。低ECM狀態(tài)下的MT1顯示細(xì)胞凋亡減少，循環(huán)小管細(xì)胞減少，以及嚴(yán)重的代謝功能障礙，限制了修復(fù)的潛力。活化的B、T和漿細(xì)胞在高ECM狀態(tài)下增加，而巨噬細(xì)胞亞型在低ECM狀態(tài)下增加。移植后數(shù)年檢測(cè)到腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞和供體來(lái)源的巨噬細(xì)胞之間的細(xì)胞間通信，在損傷的增殖中起著關(guān)鍵作用。因此確定了新的分子靶點(diǎn)，旨在改善或防止腎移植受體的同種異體移植纖維生成。

使用Banff標(biāo)準(zhǔn)，活檢樣本被分類為IFTA或正常/非特異性。41,893個(gè)單核的UMAP整合產(chǎn)生了18個(gè)主要的細(xì)胞簇。在纖維化和正常之間的1755個(gè)差異表達(dá)基因中，1006個(gè)DEG在纖維化中上調(diào)，118個(gè)與人類核心基質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)重疊。在纖維化同種異體移植活檢中，除了免疫細(xì)胞的不同類型和轉(zhuǎn)錄譜外，還鑒定了ECM基因譜的定性和定量差異。纖維化活檢分為兩種狀態(tài)，低ECM和高ECM。核心染色體基因在高ECM狀態(tài)下比低ECM狀態(tài)下更豐富。FN1、COL1A1和VCAN在高ECM中存在差異表達(dá)。為了驗(yàn)證蛋白水平上的基因表達(dá)，腎活檢的成像細(xì)胞計(jì)數(shù)(IMC)證實(shí)了ECM沉積的存在和水平。COL1A1和VIM的表達(dá)從正常<低ECM<高ECM增加。GO分析顯示，高ECM中炎癥反應(yīng)上調(diào)，與較高比例的免疫細(xì)胞相一致。纖維化中上調(diào)基因的通路和富集分析在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、傷口愈合和上皮細(xì)胞分化中具有重要意義。

2. 移植腎的細(xì)胞分布

近端腎小管(PT)細(xì)胞在正常腎移植物中大量存在。與正常移植物相比，高ECM組PTs顯著降低，低ECM組PTs略有降低。與正常移植物相比，兩種纖維化狀態(tài)下成纖維細(xì)胞(FB)亞簇FB1升高。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)亞簇EC2在高ECM狀態(tài)下更為豐富。與正相比，混合管狀(MT)亞簇MT1在纖維化中的比例過(guò)高。免疫細(xì)胞從正常到低ECM到高ECM顯著增加。低ECM和高ECM顯示了不同的氧化石墨烯富集項(xiàng)和途徑。KCNIP4在纖維化狀態(tài)特異性的小管簇中上調(diào)。KCNIP4在促炎、促纖維化狀態(tài)下上調(diào)，這種狀態(tài)在急性腎損傷后持續(xù)存在。低和高ECM狀態(tài)表現(xiàn)出不同的細(xì)胞分布和轉(zhuǎn)錄譜，支持纖維化狀態(tài)的異質(zhì)性。

2. 小管上皮細(xì)胞損傷和移植物纖維化

兩種纖維化狀態(tài)下PT生理通路均下調(diào)。脂質(zhì)和脂肪酸代謝改變?cè)诘虴CM中更為顯著。細(xì)胞周期阻滯與腎損傷有關(guān)，在腎小管細(xì)胞保護(hù)和不適應(yīng)修復(fù)中起著重要作用。所鑒定的小管細(xì)胞簇(PT, MT1, MT2)在三組之間存在與細(xì)胞循環(huán)比例相關(guān)的差異，與正常相比，低ECM時(shí)略有下降，高ECM時(shí)略有增加。與高ECM和正常ECM相比，低ECM顯示G2M細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)減少。同種異體纖維化移植物的DEG分析顯示，MT1過(guò)表達(dá)的基因富集于肌動(dòng)蛋白絲基礎(chǔ)過(guò)程、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、受體酪氨酸激酶和VEGF信號(hào)傳導(dǎo)。高ECM的特征是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、白細(xì)胞分化和WNT信號(hào)傳導(dǎo)。

在纖維化同種異體移植物中，MT1下調(diào)氨基酸降解，高ECM中T細(xì)胞的活化和分化富集。MT1是上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的中間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。對(duì)于正常移植物，細(xì)胞軌跡終止于FB1，而纖維化移植物的軌跡延伸至FB2簇。這些離散的偽時(shí)間軌跡表明，基因表達(dá)的變化說(shuō)明了兩種不同的FB譜系起源于并結(jié)束于PT，導(dǎo)致從PT到FB2集群的功能轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，MT1共表達(dá)PT和損傷25個(gè)marker。高ECM狀態(tài)下的MT1表達(dá)更高水平的損傷marker。移植物損傷和正常PT標(biāo)記物的正常表達(dá)可能是持續(xù)的亞臨床免疫反應(yīng)和慢性暴露于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的結(jié)果。在高ECM的MT1中，增殖標(biāo)記物(MKI67)和凋亡標(biāo)記物(CASP3)的共同上調(diào)，受損PT細(xì)胞亞群經(jīng)歷了損傷誘導(dǎo)的復(fù)制。與低ECM和正常相比，高ECM MT1的SLC34A1表達(dá)減少，表明損傷的PT細(xì)胞去分化。在早期腎臟發(fā)育期間正常表達(dá)的腎源性特征與高ECM相關(guān)，而在低ECM中沒(méi)有觀察到。MT2細(xì)胞不像MT1細(xì)胞那么豐富，主要存在于正常的同種異體移植物中。

3. 腎移植物中的成纖維細(xì)胞亞型

鑒定出兩種不同的成纖維細(xì)胞簇(FB1, FB2)。FB1在纖維化腎臟中更豐富，富含肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物。低ECM中FB1的GO分析顯示細(xì)胞連接、局灶黏附和VEGF信號(hào)通路上調(diào)，而高ECM中ECM組織、平滑肌收縮和傷口愈合上調(diào)。FB2在高ECM中占主導(dǎo)地位，由PDGFR-β表達(dá)定義，并在周細(xì)胞標(biāo)記物中富集。FB2相關(guān)信號(hào)通路包括RhoA、NOTCH和整合素激酶信號(hào)。在高ECM中，F(xiàn)B2通路與肌動(dòng)蛋白絲為基礎(chǔ)的過(guò)程、局灶黏附以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和黏附的正向調(diào)節(jié)有關(guān)。FB1-2在高ECM中比低ECM中轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)。譜系圖譜分析確定了FB在正常和纖維化狀態(tài)下的重編程軌跡。正常移植物中的FBs沿偽時(shí)間軌跡是均勻的，而纖維化移植物中的FBs則是不均勻的。這一數(shù)據(jù)支持FB在纖維化移植物中的功能表型轉(zhuǎn)變。

4. 衰竭腎臟的免疫系統(tǒng)

總共分析了2,655個(gè)免疫細(xì)胞，并在研究組中確定了12個(gè)免疫亞群。正常同種異體移植物的免疫細(xì)胞最少。低ECM的骨髓細(xì)胞比例最高，包括各種巨噬細(xì)胞(MΦ1, MΦ2)，經(jīng)典和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(cDC, pDC)和肥大細(xì)胞。高ECM的B細(xì)胞、血漿細(xì)胞、T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例最高。免疫細(xì)胞(T (CD4+， CD8+)， B (CD20+)和MΦ (CD68+))的相對(duì)比例和空間分布通過(guò)福爾馬林固定石蠟包埋活檢的IMC染色進(jìn)行評(píng)估。

高ECM的T細(xì)胞簇富集了與B和T細(xì)胞活化、NF-kB信號(hào)、TCR信號(hào)和Th17細(xì)胞分化相關(guān)的DEGs，這與MT1簇富集的活性增加相匹配。B細(xì)胞通路相關(guān)基因包括B細(xì)胞活化、白細(xì)胞趨化、內(nèi)吞作用以及NF-kB和FC受體介導(dǎo)的刺激信號(hào)通路的調(diào)控。高ECM的漿細(xì)胞具有活躍的轉(zhuǎn)錄譜。

鑒定出三個(gè)巨噬細(xì)胞簇(MΦ1-3)，并以常見(jiàn)的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CSF1R, MANBA, PLXDC2, RTN1, GRK3)為特征。MΦ1s通過(guò)抗原加工和遞呈上調(diào)、HLA II類基因上調(diào)和Th1/Th2/Th17細(xì)胞分化進(jìn)行分類。MΦ2s(以STAB1, F13A1, CD163, NRP1為特征)顯示MHC ii類介導(dǎo)的抗原呈遞和巨噬細(xì)胞M2相關(guān)的吞噬。MΦ1-2在高ECM腎移植物中也過(guò)表達(dá)CD74。

低ECM擁有最大的MΦ1和MΦ2群。在兩種纖維化狀態(tài)下，MΦ2的表達(dá)譜與細(xì)胞粘附和內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)有關(guān)，而IFN-α和-γ反應(yīng)是高ECM所特有的。

使用三組性別不匹配病例的XY染色體相關(guān)基因表達(dá)特征來(lái)評(píng)估供體與受體免疫細(xì)胞對(duì)同種異體移植物的貢獻(xiàn)。免疫細(xì)胞主要來(lái)自受體，小部分來(lái)自供體。沒(méi)有證據(jù)表明受體存在非免疫細(xì)胞。對(duì)于一些樣本，根據(jù)性別特異性基因的表達(dá)將免疫細(xì)胞群分為供體/受體特異性免疫細(xì)。移植后60個(gè)月，供體免疫細(xì)胞在腎移植中被鑒定出來(lái)。對(duì)樣本KUT040中特定細(xì)胞類型的供體和受體標(biāo)記的免疫細(xì)胞之間的DEGs進(jìn)行了評(píng)估。這項(xiàng)原理驗(yàn)證分析顯示，基于供體/受體來(lái)源的免疫細(xì)胞的差異貢獻(xiàn)，支持常駐巨噬細(xì)胞在腎移植中介導(dǎo)和加劇免疫介導(dǎo)的炎癥中的重要作用。

5. 纖維化過(guò)程中的旁分泌信號(hào)

配體受體(LR)分析集中在細(xì)胞比例有顯著差異的簇上，并在腎纖維化中具有重要意義。它們的成纖維細(xì)胞受體具有共同的功能作用，包括成纖維細(xì)胞激活和ECM擴(kuò)展。

PDGFC是一種強(qiáng)效的促纖維化絲裂原，在纖維化移植物中分泌，支持成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。NOTCH信號(hào)通路的上調(diào)也是共有的。TLRs通過(guò)DLL1觸發(fā)巨噬細(xì)胞中的NOTCH信號(hào)，DLL1是高ECM分泌的主要NOTCH配體。對(duì)于低ECM, FB1-MΦ3 LRs也參與PI3K-Akt-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)于低ECM, MT1-MΦ3和MT1-MΦ1 LRs參與趨化性和管狀/組織形態(tài)發(fā)生。細(xì)胞極性調(diào)節(jié)劑CELSR1-PSAP和成纖維細(xì)胞增殖和激活調(diào)節(jié)劑FGFR2-MAPK1等相互作用進(jìn)一步支持低ECM中的EMT。在高ECM中，MT1-MΦ1(和FB1-MΦ1)相互作用反映了細(xì)胞因子介導(dǎo)的和NIK/NF-kB信號(hào)通路，與增加的免疫細(xì)胞豐度和激活一致。H&E和IHC染色進(jìn)一步證實(shí)了LR與浸潤(rùn)細(xì)胞和受損腎臟結(jié)構(gòu)的相互作用。低ECM腎實(shí)質(zhì)顯示纖維化斑塊，而高ECM顯示更緊密的纖維化區(qū)域。間質(zhì)間存在和相對(duì)豐富的肌成纖維細(xì)胞在纖維化發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。