之前我們揭秘了 3 種抗體驗證策略——二元策略、范圍策略、正交策略，下面繼續(xù)跟隨小編學(xué)習(xí) CST 完整的抗體驗證系統(tǒng)。教你挑選值得信賴的抗體！
CST 抗體驗證第 4 個策略——多種抗體策略。
多種抗體策略是一種強大的抗體驗證方法。實現(xiàn)此目標(biāo)的最常見方法之一是使用一種抗體進行靶標(biāo)的免疫沉淀 (IP)，然后通過用另一種針對相同靶標(biāo)的抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析檢測。這能確定兩種抗體結(jié)合正確的生物分子。
多種抗體驗證的另一種熟悉方法涉及使用針對同一靶標(biāo)上不同、不重疊表位的兩種或多種抗體，以產(chǎn)生直接可比的免疫染色數(shù)據(jù)。這通常通過蛋白質(zhì)印跡，免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)等技術(shù)來證明。通過平行地用多種抗體檢測相同的樣品，可以相對快速直觀地了解抗體特異性。
在沒有兩種針對同一靶標(biāo)的抗體的情況下，可以采用其他策略來確定抗體特異性。例如，免疫沉淀聯(lián)合隨后的質(zhì)譜分析方法越來越多地用于檢測經(jīng)過評估中抗體富集的蛋白。
跟采用抗體驗證標(biāo)志的其他任何一種一樣，多種抗體策略絕不應(yīng)成為確定抗體特異性的唯.一策略。例如，免疫組織化學(xué)檢測的抗體結(jié)果可比，但實際上兩種試劑均識別相同的不正確、非靶標(biāo)生物分子，為消除這種可能性，應(yīng)始終通過其他抗體驗證策略來支持多種抗體檢測數(shù)據(jù)。此外，不應(yīng)以“盲法”方式使用多種抗體方法作為篩選或選擇抗體的手段；所有經(jīng)這種方法檢測的抗體都應(yīng)使用"抗體驗證系列"中概述的其他策略獨立驗證。
多種抗體策略具體方法如下：
免疫沉淀
免疫沉淀是多種抗體驗證最顯而易見的方法之一，明確地直觀顯示兩種不同的抗體結(jié)合同一個靶標(biāo)。如果抗體識別分子的不同區(qū)域，則證據(jù)最充分，如圖 1 所示。在這里，NeuN (E4M5P) 小鼠單克隆抗體已用于免疫沉淀大鼠腦提取物的 NeuN 蛋白，NeuN (D4G4O) Rabbit mAb 已用于蛋白質(zhì)印跡分析。圖 2 顯示了類似的數(shù)據(jù)集，其中 TAZ (EBE9G) Rabbit mAb 用于免疫沉淀，第二種 TAZ (D316D) Rabbit mAb 用于免疫印跡。在這兩種情況下，加入同種型對照均有助于確認(rèn)抗體的特異性。
Figure 1
對大鼠腦組織提取物的 NeuN 蛋白進行免疫沉淀。泳道 1 為 10% input，泳道 2 為 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656，泳道 3 為 NeuN (E4M5P)。使用 NeuN (D4G4O) 進行蛋白質(zhì)印跡分析。
Figure 2
對 HeLa 細(xì)胞提取物的 TAZ 蛋白進行的免疫沉淀。泳道 1 為 10% input，泳道 2 為 Rabbit (DA1E) Isotype Control，泳道 3 為 TAZ (E8E9G)。使用 TAZ (D3I6D) Rabbit mAb #70148 進行蛋白印跡分析。
不同抗原檢測
通過免疫染色技術(shù)使用多種抗體檢測相同樣本是確認(rèn)抗體特異性的簡單但未充分利用的方法。如果兩種或多種不同的抗體試劑顯示出相同的染色模式或抗原定位，則可以確信抗體正在特異性地對靶標(biāo)進行染色。
可以使用先前驗證的抗體來確認(rèn)從正在驗證的抗體中觀察到的免疫染色數(shù)據(jù)。如果采用測試抗體獲得的結(jié)果可重現(xiàn)經(jīng)過驗證的抗體的結(jié)果，則這被視為特異性的指標(biāo)。例如，圖 3顯示了采用可識別人蛋白質(zhì)上不同表位的兩種 Helios 兔單克隆抗體進行的兩種不同組織類型的免疫組織化學(xué)分析。兩種組織中的染色模式相當(dāng)，表明兩種抗體都對靶標(biāo)具有特異性。在圖 4 中，使用兩種不同的 MAGE-A4 兔單克隆抗體對人鱗狀細(xì)胞肺癌組織染色。再次，兩種抗體都可以看見類似染色，為它們的特異性提供可信度。
除了提供可識別同一靶標(biāo)上不同表位的兩種抗體的平行數(shù)據(jù)外，理想的情況是在多種產(chǎn)品中查找可比數(shù)據(jù)。例如，圖 5 和 6 顯示與兩種不同的抗 CD200 抗體相關(guān)的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)相似，突顯了用于檢測抗體的模型一致性和產(chǎn)生結(jié)果的相似性。相反，如果針對同一靶標(biāo)的兩種不同產(chǎn)品的數(shù)據(jù)差異很大，則結(jié)果的有效性可能會受到質(zhì)疑。
Figure 3
使用 Helios (E4L5U)（上圖）或 Helios 抗體（下圖）對石蠟包埋的人 B 細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤（左圖）或前列腺癌（右圖）細(xì)胞進行免疫組織化學(xué)分析。這兩種抗體可檢測人 Helios 上的獨立、獨特表位。使用兩種抗體獲得的相似染色模式有助于確認(rèn)染色特異性。
Figure 4
使用 MAGE-A4 (E7O1U)（上圖）或 MAGE-A4 Antibody（下圖）對石蠟包埋的人鱗狀細(xì)胞肺癌進行免疫組織化學(xué)分析。這兩種抗體可檢測人 MAGE-A4 上的獨立、獨特表位。使用兩種抗體獲得的相似染色模式有助于確認(rèn)染色特異性。
Figure 5
使用 CD200 (E5I9V)（上圖）或 β-Actin (D6A8)（下圖）對不同細(xì)胞系的提取物進行蛋白質(zhì)印跡分析。
Figure 6
使用 CD200 (E2K4C)（上圖）和 β-Actin (D6A8)（下圖）對不同細(xì)胞系的提取物進行蛋白質(zhì)印跡分析。
染色質(zhì)免疫沉淀
也可使用多種抗體驗證染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 實驗結(jié)果。ChIP 用于識別與體內(nèi)特定染色質(zhì)片段結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子，可用于探測細(xì)胞天然染色質(zhì)環(huán)境中的蛋白質(zhì)-DNA 相互作用。通過使用針對同一靶蛋白的非重疊表位的多種抗體，或針對同一 DNA 結(jié)合復(fù)合物中不同靶蛋白的多種抗體，并且將 ChIP 與 qPCR 或 NG-seq 聯(lián)合分析，研究人員就能從一種用途廣泛的抗體交叉驗證方法中受益。
圖 7 顯示了使用針對 SW1/SNF 復(fù)合物中三種不同蛋白質(zhì)靶標(biāo)的三種抗體 SMARCC1、SMARCB1 和 SS18 進行實驗所得的 ChIP 數(shù)據(jù)。經(jīng)過 ChIP 和隨后的 NG-seq 分析，可以看出所有三種抗體均產(chǎn)生非常相似的結(jié)果。
Figure 7
使用 SimpleChIP? Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 對在無酚紅的培養(yǎng)基和 5% 活性炭剝離的 FBS 中生長 4 天，隨后使用 β-雌二醇（10 nM，45 分鐘）處理的 MCF7 細(xì)胞的交聯(lián)染色質(zhì)與 SMARCC1/BAF155 (D7F8S)、SMARCB1/BAF47 (D8M1X) 或 SS18 (D6I4Z) 進行染色質(zhì)免疫沉淀。使用 SimpleChIP? ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina? 制備 DNA 庫。SMARCC1/BAF155、SMARCB1/BAF47 和 SS18 均為 SWI/SNF 復(fù)合體的所有亞基。結(jié)果圖顯示了三個亞基與 pS2/TFF1 基因結(jié)合，pS2/TFF1 是一種已知的 SWI/SNF 靶標(biāo)基因。
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