【樞密新成果】用于制備乙肝動物模型的“rAAV8-1.3xHBV”
一、 背景
乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 屬于嗜肝DNA病毒科 (Hepadanaviridae)，具有很強(qiáng)的感染性，其基因組為松散的環(huán)狀雙鏈DNA (relaxd circular DNA, RC DNA)，通過在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成共價(jià)閉環(huán)的DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 作為轉(zhuǎn)錄模版，形成乙肝病毒擴(kuò)增所必需的前基因組RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成負(fù)鏈DNA，DNA復(fù)制形成雙鏈DNA，完成病毒基因組的擴(kuò)增過程[1]。慢性乙肝病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟病變或衰竭，甚至造成癌癥。雖然通過接種乙肝疫苗可以有效預(yù)防HBV的感染，但現(xiàn)有療法不能完全清除病毒，全世界仍有約2.57億（3.5%）人口感染HBV，其中非洲、中東、中國和東南亞以及西太平洋地區(qū)感染率較高，共計(jì)約2.35億人口，存在巨大的未被滿足的需求[2]。
現(xiàn)有乙肝治療藥物主要為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和干擾素，需長期用藥，一旦停止病毒就會重新爆發(fā)。2018年11月，FDA發(fā)布的抗乙肝病毒感染藥物開發(fā)指南，提出開發(fā)新型乙肝療法的目標(biāo)是“在治療結(jié)束后較低的病毒復(fù)發(fā)和肝臟疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)”[3]，這意味著臨床前藥物評估需要在能模擬乙肝病毒長期感染的動物模型中進(jìn)行。然而乙肝病毒宿主范圍狹窄，不容易直接建立長期感染的動物模型。目前廣泛采用重組腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus, AAV) 載體攜帶乙肝病毒體內(nèi)表達(dá)的方式實(shí)現(xiàn)長期感染的動物模型。
二、 rAAV8-1.3xHBV簡介
樞密科技利用AAV基因組能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在的特性以及8型AAV嗜肝性的特點(diǎn)，開發(fā)了攜帶1.3拷貝HBV全長基因組的腺相關(guān)病毒產(chǎn)品rAAV8-1.3xHBV（血清型：ayw，基因型：D）[4]，其模擬了pgRNA的形成，更貼近病毒天然的生活周期，能穩(wěn)定的建立乙肝病毒長期感染的狀態(tài)。通過小鼠尾部靜脈注射制備HBV持續(xù)性感染的動物模型應(yīng)用于HBV藥物評價(jià)和篩查的研究。此產(chǎn)品線可方便、快速的為科研院校以及工業(yè)客戶等提供穩(wěn)定的、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品服務(wù)。
1. 分子構(gòu)建
圖1. 用于建立乙肝病毒感染動物模型的AAV-1.3xHBV產(chǎn)品基因組結(jié)構(gòu)示意圖，包含完整乙肝病毒基因組的4個(gè)開放讀碼框和上游重復(fù)區(qū)域。
1. 效果驗(yàn)證
C57小鼠靜脈注射總量分別為2.3x1010vg，5x1010vg和10x1010vg按比例稀釋的病毒液，體積為200uL。 眼眶采血檢測血清中乙肝病毒標(biāo)記物HBsAg、HBeAg和DNA含量，連續(xù)觀察7周。
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圖2. 用AAV-1.3xHBV建立小鼠乙肝病毒長期感染模型效果測試。A-C，不同劑量病毒尾靜脈注射，檢
測血清乙肝病毒標(biāo)記物含量，每個(gè)劑量組檢測5只小鼠。D-F，最高劑量組5只小鼠乙肝病毒標(biāo)記物個(gè)體檢測結(jié)果
1. 乙肝病毒感染小鼠模型比較
目前用于研究的乙肝動物模型有HBV樹鼩模型、土撥鼠肝炎病毒和鴨肝炎病毒，但這些動物并未建立純系品種，難以標(biāo)準(zhǔn)化，且后兩者由于和人HBV親緣性較遠(yuǎn)，難以模擬人感染HBV的病理特征。小鼠缺乏HBV受體，不能用直接感染的方法建模，目前常用的小鼠乙肝病毒感染模型各有優(yōu)劣，如下表所示：
表1. 小鼠乙肝病毒感染模型比較
一、 樞密優(yōu)勢
樞密的生產(chǎn)系統(tǒng)、質(zhì)控系統(tǒng)都嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)文件執(zhí)行，可確保產(chǎn)品的質(zhì)量和批次間的穩(wěn)定性。rAAV8-1.3xHBV在生產(chǎn)的過程中采用的系統(tǒng)不含人源細(xì)胞系，避免了生產(chǎn)過程中產(chǎn)生野生型HBV病毒顆粒的風(fēng)險(xiǎn)，安全性高，此系統(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)而且具有較高的產(chǎn)率和穩(wěn)定性。因此，樞密開發(fā)的rAAV8-1.3xHBV既能滿足基礎(chǔ)科研，也能滿足工業(yè)客戶的要求。
腺相關(guān)病毒產(chǎn)品采用碘克沙醇密度梯度離心純化，通過熒光定量PCR檢測AAV基因組ITR序列測定滴度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染檢測產(chǎn)品純度。
圖3. rAAV8-1.3xHBV凝膠電泳銀染。AAV的外殼由VP1、VP2、VP3三種蛋白按1:1:10比例組成，大小分別是87 KD、73 KD、62 KD，三條帶濃度越接近上述比例，病毒質(zhì)量越好。
一、 使用環(huán)境及注意事項(xiàng)
? 重組腺相關(guān)病毒屬于復(fù)制缺陷型的假病毒載體，但rAAV8-1.3xHBV攜帶致病基因，其病毒產(chǎn)品和受感染的動物對人具有感染性和致病性，應(yīng)在生物安全二級條件下操作使用，運(yùn)輸過程也需做到隔離防護(hù)。
? 操作人員需要經(jīng)過專業(yè)的生物安全培訓(xùn)并獲得生物安全培訓(xùn)合格證，嚴(yán)格按照生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程和手冊進(jìn)行操作。建議操作人員接種乙型肝炎疫苗以獲得乙肝免疫能力。
? 感染了rAAV8-1.3xHBV的小鼠排泄物等可能含有HBV病毒，該HBV病毒對包括人在內(nèi)的靈長類動物有潛在感染性和致病性，對樹鼩、鴨子等動物的均具有感染性，故實(shí)驗(yàn)動物及廢棄物的處理需要嚴(yán)格遵循生物安全實(shí)驗(yàn)規(guī)程。
? 該病毒產(chǎn)品及其動物模型的使用單位應(yīng)該有生物安全二級實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)。
二、 運(yùn)輸及保存方法
? 病毒采用干冰運(yùn)輸，通常1-2天送達(dá)。
? 病毒可在4℃短期保存1-2周，但滴度會有4-5倍的降低。長期保存需存放于-80℃。每凍融一次，病毒滴度降低10%左右，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
? 理論上，病毒可于-80℃保存6個(gè)月以上，但病毒儲存時(shí)間超過6個(gè)月后，建議在使用前重新測定滴度。
? 避免細(xì)菌、蛋白酶等污染。
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