病料采集
病料，是在進(jìn)行疾病診斷或檢疫時(shí)，從患病個(gè)體采集的可供檢測(cè)分析的材料樣品。病料采集是否得當(dāng)，直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果是否正確。有時(shí)對(duì)不同疾病要采集不同的樣品，差異很大。
1、采集病料時(shí)應(yīng)遵循如下原則
（1）適時(shí)采樣：根據(jù)檢測(cè)要求、檢測(cè)對(duì)象和檢驗(yàn)項(xiàng)目的不同，選擇適當(dāng)?shù)牟蓸訒r(shí)機(jī)十分重要。樣品是有時(shí)間要求的，應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定時(shí)間采樣；有臨床癥狀需要做病原分離的，樣品必須在病初的發(fā)熱期或癥狀典型時(shí)采樣；病死的豬應(yīng)立即采樣，最長(zhǎng)不能超過6小時(shí)。
（2）合理采樣：根據(jù)診斷檢測(cè)要求，除嚴(yán)格按照規(guī)定采集各種足夠數(shù)量的樣品外，不同的疫病所需檢測(cè)的樣品有所區(qū)別，應(yīng)按可能的疫病側(cè)重采集。對(duì)于未能確定為何種疫病時(shí)，應(yīng)全面采集。數(shù)量除滿足診斷檢測(cè)的需要，還應(yīng)留有余地，以備必要時(shí)復(fù)檢使用。
（3)典型采樣：選取未經(jīng)治療、癥狀最典型或病變最明顯的病例，如果有并發(fā)癥，還應(yīng)兼顧進(jìn)行采樣。
（4）無菌采樣：采集的檢驗(yàn)樣品除供病理組織學(xué)檢驗(yàn)外，還供病原學(xué)與血清學(xué)檢驗(yàn)，所以必須無菌操作采樣，采樣用具、容器均須滅菌處理。尸體剖檢需采集樣品的，先采樣后檢查，以免人為污染樣品。
（5）樣品處理：采集的樣品應(yīng)一種樣品一個(gè)容器，立即密封，根據(jù)樣品的性狀及檢驗(yàn)要求不同，做暫時(shí)的冷藏、冷凍或其他處理。供病毒學(xué)檢驗(yàn)的樣品，數(shù)小時(shí)內(nèi)要送到實(shí)驗(yàn)室，只做冷藏處理，超過數(shù)小時(shí)的應(yīng)凍結(jié)處理。凍結(jié)方法：可將樣品放入-30°C冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后再裝入有大小冰塊或干冰的冷藏箱內(nèi)運(yùn)送；也可將裝入樣品的容器放入隔熱保溫瓶?jī)?nèi)，再放入冰塊，然后按100克冰塊加入食鹽約35克，立即將保溫瓶口塞緊。供細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)或血清學(xué)檢驗(yàn)的樣品冷藏送實(shí)驗(yàn)室即可。
（6）安全采樣：采樣過程中，須做好采樣人員的安全防護(hù)，并防止病原污染，尤其必須防止外來疫病或重大疫病的擴(kuò)散，避免事故發(fā)生。
（7）樣品包裝：裝盛樣品的容器可選擇玻璃或塑料的，可以是瓶子、試管或袋子。容器必須完整無損，密封不使液體漏出。裝供病原學(xué)檢驗(yàn)樣品的容器，用前應(yīng)徹底清洗干凈，必要時(shí)經(jīng)清潔液浸泡，沖洗干凈后以干烤或高壓滅菌并烘干。如用塑料容器，能耐高壓的經(jīng)高壓消毒，不能耐高壓的經(jīng)EO熏蒸消毒或紫外線消毒滅菌后使用。
（8）迅速送檢：樣品經(jīng)包裝密封后，必須盡快送往實(shí)驗(yàn)室，延誤送檢時(shí)間，會(huì)影響診斷結(jié)果。供細(xì)菌檢驗(yàn)、寄生蟲檢驗(yàn)及血清學(xué)檢驗(yàn)的冷藏樣品，必須在24小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室；供病毒檢驗(yàn)的冷藏處理樣品，須在數(shù)小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)凍結(jié)的樣品須在24小時(shí)內(nèi)送到，24小時(shí)內(nèi)不能送到實(shí)驗(yàn)室的，需要在運(yùn)送過程中保持樣品處于-20°C以下。
2、病料的采取方法
（1） 膿汁——先將表面流水線，然后以滅菌注射器或吸管抽取深部的濃汁;若是開口化膿灶或皮膚,粘膜表面化膿,可用滅菌棉拭子浸沾膿汁后,放入試管中。
（2）內(nèi)臟器官——采取心、肺、肝、脾，腎等有病變的組織及其淋巴結(jié)，無病變時(shí)也要采取，無菌剪取1-2cm大的方塊,分別裝入滅菌容器內(nèi)。
（3）血液——要全血時(shí),無菌采取血液10m，立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%檸檬酸鈉液1ml的滅菌試管內(nèi)，并立即混合均勻。要分離血清時(shí)，將無菌采取的血液直接注入滅菌試管，待血液自然凝固后分離血清。從尸體采取血液時(shí)，可用滅菌注射器或吸管從右心房抽取。
（4）皮膚和粘膜——采取病變局部的皮膚和粘膜及其所屬淋巴結(jié)，放入甘油鹽水溶液中。
（5）腦和脊髓——無菌采取腦的脊髓約1-2cm大的方塊，放入甘油鹽水溶液中。
（6）膽汁——用滅菌注射器抽出后放入滅菌試管中。
（7）腸和胃——剪取有病變的部位一段或一塊。也可將腸管一段(約6-8cm)用線扎緊兩端后剪下送往實(shí)驗(yàn)室。
（8）糞便——可用棉拭子插入肛門沾取，或撲殺病畜后由腸管采取，立即放低溫條件下保存。
（9）乳汁——先用消毒藥液洗凈乳頭及其附近，棄去最初擠出的幾滴乳汁，然后采取乳汁約10ml放入滅菌試管內(nèi)。
（10）流產(chǎn)胎兒——可將整個(gè)胎兒用塑料薄膜包緊，裝入箱中送檢。
（11）小動(dòng)物、禽和魚等，可按上述流產(chǎn)胎兒方式整體送檢。在距離實(shí)驗(yàn)室很近，又有隔離運(yùn)輸條件時(shí)，也可將發(fā)病小動(dòng)物直接送檢。
3、病料的處理
（1）初步觀察：
采集的病料，在接種培養(yǎng)前，應(yīng)對(duì)其性狀進(jìn)行觀察，例如：是否膿性帶血或腐敗，有何異味，并作記錄。各種病料在分離培養(yǎng)前均應(yīng)制備一張涂片，作革蘭氏染色、鏡檢，以了解細(xì)菌的形態(tài)，染色特性，并大致估計(jì)其含菌量。通過肉眼觀察和顯微鏡下看到的結(jié)果，對(duì)病料中可能含有的病原菌作最初步的估價(jià)。
（2）處理判斷：
如果病料是病變組織，又是用無菌方法采集的，在接種前一般無需作特別處理。
但如果病料被雜菌污染嚴(yán)重，則需根據(jù)要分離的病原菌的特性，采用一些對(duì)病原菌無害，但對(duì)雜菌有殺滅或抑制作用的方法，以抑制雜菌生長(zhǎng)。
?例如從糞便中分離沙門氏桿菌，可將糞合接種于Na2SeO3肉湯中，作增菌處理。在這種培養(yǎng)基中，其它雜菌被抑制，而沙門氏桿菌則能自由繁殖。
?又如，分離布魯氏桿菌、胎兒彎曲桿菌、炭疽桿菌、副結(jié)核桿菌可用選擇性抗菌瓊脂。分離鏈球菌和豬丹毒桿菌用疊氮鈉結(jié)晶紫血瓊脂等。
?如果從腸道內(nèi)容物或從污染有不產(chǎn)生芽胞的雜菌培養(yǎng)物中分離能形成芽胞的細(xì)菌(如魏氏梭菌,破傷風(fēng)梭菌等)，可將病料在80℃加熱15分鐘，以殺死不形成芽胞的雜菌，取此材料再接種培養(yǎng)基，即容易獲得純培養(yǎng)物。
?如有些病料(奶，尿等)含菌太少，則應(yīng)先作集菌處理，然后接種，以提高檢出率，其集菌方法有離心法和過濾法。離心法取沉淀物作培養(yǎng)物，過濾后取沉積于濾板上表面的病料作培養(yǎng)。
?還有些細(xì)菌往往在細(xì)胞漿內(nèi)集結(jié)成團(tuán)，在它們所形成的病灶中含菌較少，遇到這種情況，可將病料組織磨碎，制成乳劑，加入酶、酸或堿，消化組織，使菌團(tuán)散開，然后離心，收集沉淀物作培養(yǎng)(如從腸粘膜分離副結(jié)核桿菌即用此法)。
細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無菌室和超凈工作臺(tái)等。
1、接種用具
耐思 1ul/10ul 接種環(huán)、接種針
包括接種環(huán)和接種針兩類。接種環(huán)用來挑取標(biāo)本、菌液及平板劃線等。接種針則用來挑取單個(gè)菌落，穿刺高層瓊脂等。
接種環(huán)(針)由環(huán)(針)、金屬柄和絕緣柄3部分組成，環(huán)(針)一般采用鉑絲制作最佳，其硬度適宜，易于傳熱，火焰滅菌后冷卻快，經(jīng)久耐用。但因其價(jià)格昂貴，目前多用電熱(鎳)絲及一次性塑料接種環(huán)代替。
接種環(huán)的直徑一般為2～4mm，長(zhǎng)5～8cm，定量接種環(huán)容量為1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)箱
（1）普通培養(yǎng)箱，可自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度(一般為35～37℃)，用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。
（2）二氧化碳培養(yǎng)箱，可自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳濃度(一般為5％～l0％)和培養(yǎng)溫度，用于分離培養(yǎng)嗜血桿菌和奈瑟菌等生長(zhǎng)時(shí)需二氧化碳的細(xì)菌，尤其是初次分離培養(yǎng)時(shí)。如無二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，也可用燭缸法代替。
（3）厭氧袋、厭氧罐(盒)和厭氧手套箱用于分離培養(yǎng)厭氧菌。厭氧袋為透明的、不透氣的塑料袋。厭氧罐為密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化學(xué)方法去除袋、罐中的氧氣，達(dá)到無氧狀態(tài)。厭氧手套箱則可通過換氣裝置快速達(dá)到、持續(xù)保持無氧狀態(tài)，并自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度，還可通過手套在箱內(nèi)進(jìn)行分離接種、生化鑒定等操作。
3、培養(yǎng)基
耐思 500ml/1000ml 試劑瓶
培養(yǎng)基(culture medium)是由人工方法配制而成的，適合微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細(xì)菌的生理、化學(xué)特性，是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。培養(yǎng)基按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按其用途分為基礎(chǔ)、營養(yǎng)、選擇、鑒別和特殊培養(yǎng)基。
（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基(based medium) 含有基礎(chǔ)生長(zhǎng)所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基礎(chǔ)培養(yǎng)基廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗(yàn)，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrient medium) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)。最常用的是血瓊脂平板、巧克力平板等。
（3）選擇培養(yǎng)基(selective medium) 在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制物質(zhì)，有利于目的菌的檢出和識(shí)別，而抑制其他非目的菌。例如，麥康凱瓊脂平板可以抑制球菌及革蘭陽性桿菌生長(zhǎng)，有利于腸道菌生長(zhǎng)，稱弱選擇性培養(yǎng)基；SS瓊脂平板除有上述作用外，還可抑制腸道非致病菌的生長(zhǎng)，故稱強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基。
（4）鑒別培養(yǎng)基(differential medium)利用細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用于觀察細(xì)菌各種生化反應(yīng)，以鑒別和鑒定細(xì)菌。例如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)(美藍(lán))瓊脂等。
（5）特殊培養(yǎng)基(special medium) 包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基，除含營養(yǎng)成分外，還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)。后者是針對(duì)細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌L型，由于胞內(nèi)滲透壓較高，故培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。
為了從臨床標(biāo)本中分離出病原菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標(biāo)本的來源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。
耐思 細(xì)菌皿
底部3/6/9/12點(diǎn)處有數(shù)字標(biāo)記，方便確定細(xì)菌位置
1、平板劃線分離法
使標(biāo)本或培養(yǎng)物中混雜的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長(zhǎng)，各自形成菌落。一般要求單個(gè)菌落是一種細(xì)菌的純培養(yǎng)。但很多情況下單個(gè)菌落并非只有一種細(xì)菌，特別是標(biāo)本直接劃線的開始區(qū)域生長(zhǎng)的單個(gè)菌落分離結(jié)果不純，一般選擇菌落形成較稀少區(qū)域的單個(gè)菌落，必要時(shí)先稀釋標(biāo)本再劃線。待菌落長(zhǎng)出后，挑選單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種到另一培養(yǎng)基中，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。平板劃線法可分為以下幾種：
（1）分區(qū)劃線法——此法多用于糞便等含菌量較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂于平板表面邊緣一小部分(第1區(qū))；然后燒灼接種環(huán)，將環(huán)通過第l區(qū)3～4次，連續(xù)劃線(為第2區(qū))；依次劃3、4區(qū)。平板上每區(qū)的細(xì)菌數(shù)會(huì)逐漸減少，直至分離出單個(gè)菌落(圖5-4)。
（2）連續(xù)劃線法——本法一般用于接種含菌數(shù)量相對(duì)較少的標(biāo)本或培養(yǎng)物。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小部分，并由此開始，在平板表面連續(xù)劃線并逐漸下移，直至劃滿平板表面。
（3）棋盤格劃線法——此法多用于含菌量較多的臨床標(biāo)本，如痰、糞便等標(biāo)本的初代分離培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)平板的3/4～4/5區(qū)域(即棋盤格范圍)均為有效分離區(qū)。將標(biāo)本涂布于平板約1/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自原處做平行劃線5～6條。接種環(huán)燒灼后冷卻，劃垂直線5～6條，形成正方形格；再以同法劃兩排斜線，使呈棋盤形。
2、斜面接種法
該法主要用于純種增菌及保存菌種。挑取單個(gè)菌落從斜面底部自下向上劃一條直線，再從底部開始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。
3、液體接種法
以接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體應(yīng)淹沒接種物為準(zhǔn))。多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基的接種。
4、穿刺接種法
此法用于保存菌種、觀察動(dòng)力及某些生化反應(yīng)。以接種針挑取細(xì)菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。其他操作與斜面接種類似。
5、傾注平板法
取純培養(yǎng)物的稀釋液或原標(biāo)本，混勻于已融化并冷卻到50℃左右15ml的瓊脂管中，無菌法傾注于無菌平皿，凝固后培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。該法適用于兼性厭氧菌或厭氧菌稀釋定量培養(yǎng)，也用于飲料、牛乳和尿液等液體標(biāo)本活細(xì)菌計(jì)數(shù)。
1、細(xì)菌室注意事項(xiàng)
（1）細(xì)菌室必須經(jīng)常保持整潔，裝有供空氣消毒的紫外線燈，每天開始工作前，照射20分鐘。入室前要著白大衣、戴帽子、口罩，并做好實(shí)驗(yàn)前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。必須進(jìn)行登記、編號(hào)后才能進(jìn)行檢驗(yàn)。
（2）實(shí)驗(yàn)用具用完后一律放回原處，已污染的用具應(yīng)立即置5%的來蘇兒罐或燒灼后再行高壓滅菌。未污染之紙繩、火柴桿等應(yīng)集中扔在污物桶內(nèi)。
（3）分離的一類或二類菌種，除按衛(wèi)生部1985年頒發(fā)的《中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理辦法》執(zhí)行外，未經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)，不得帶出實(shí)驗(yàn)室或擅自處理。
（4）工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室不得攜帶書籍和資料，實(shí)驗(yàn)室其他特件在保證不污染、安全的前提下方可帶出。
（5）應(yīng)在指定房間進(jìn)行強(qiáng)毒操作或感染動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)者除著白大衣外，要著前掛，戴口罩、眼鏡、膠皮手套和穿膠鞋，工作結(jié)束后應(yīng)徹底消毒。
（6）在操作污染材料時(shí)，如有事故發(fā)生（如打破平皿、注射針頭脫落噴出感染材料等），所有被污染的物品及工作人員不得擅自離開原地，應(yīng)就地呼喚他人徹底消毒后方可離開原地。
（7）工作人員于操作中感染病原菌或認(rèn)為可能感染時(shí)，必須立即報(bào)告領(lǐng)導(dǎo)，盡速采取預(yù)防或隔離治療等措施。
（8）一類病原菌檢驗(yàn)必須在強(qiáng)毒室操作，操作此類細(xì)菌應(yīng)由實(shí)際工作3年以上的細(xì)菌檢驗(yàn)人員擔(dān)當(dāng)，操作時(shí)應(yīng)當(dāng)有兩名以上人員。
（9）細(xì)菌檢驗(yàn)操作必須嚴(yán)格遵守有關(guān)制度及操作規(guī)程，加強(qiáng)消毒和無菌觀念，以免發(fā)生意外。
2、操作注意事項(xiàng)
（1）由被檢驗(yàn)標(biāo)本或培養(yǎng)物中取材觀察細(xì)菌形態(tài)時(shí)，必須使用接種環(huán)。接種環(huán)系采用一段長(zhǎng)約5～8cm硬度適中的鎳質(zhì)電阻絲或特制鉑絲，安置在一金屬或玻璃棒上制成。無環(huán)者則稱接種針。
（2）接種環(huán)或接種針每次使用前后，均須火焰滅菌。即在乙醇燈火焰上徹底燒灼1次，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉(zhuǎn)動(dòng)著通過火焰3次，用后燒灼時(shí)，先將近環(huán)處鎳絲置于火焰中，使熱導(dǎo)向接種環(huán)，如直接將環(huán)燒灼，則環(huán)上殘余菌液可因突然受高熱而爆烈四濺，有傳染危險(xiǎn)。待環(huán)上菌液蒸發(fā)干涸后，再將接種環(huán)以垂直方向于火焰中燒灼滅菌，最后再將金屬棒或玻璃棒部分往復(fù)通過火焰。接種針用后滅菌時(shí)與接種環(huán)同。
（3）接種環(huán)（針）經(jīng)火焰后，需待冷卻后再沾取標(biāo)本或放置于工作臺(tái)上，以防燙死微生物和燒損桌面。
（4）由培養(yǎng)基或試管培養(yǎng)物中沾取標(biāo)本時(shí)，培養(yǎng)瓶口、試管口在打開后及關(guān)閉前，應(yīng)于火焰上通過1～2次，以殺死可能從空氣中落入的雜菌和由培養(yǎng)物而來的致病菌。打開瓶塞或試管塞時(shí)，應(yīng)將棉塞上端夾于手指間適當(dāng)?shù)奈恢茫坏脤⒚奕我夥胖脛e處。
（5）不染色標(biāo)本和染色標(biāo)本觀察后，應(yīng)立即投入消毒液內(nèi)滅菌。
（6）使用過玻片，務(wù)須徹底消除玻片上的染色細(xì)菌后再用，否則再次使用時(shí)可能做出錯(cuò)誤診斷。