?中空纖維測試法結(jié)合細(xì)胞光學(xué)成像：抗腫瘤藥物活性評估和靶標(biāo)驗證
簡介
?
體外先導(dǎo)化合物的體內(nèi)活性評估是當(dāng)前化學(xué)治療藥物研發(fā)的主要難點之一，傳統(tǒng)的評估方法是將腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷型宿主動物，然后測量形成腫瘤的大小，該方法可體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與宿主動物之間的相互作用，且測量過程無侵害性，有利于進行進一步的縱向研究，但是腫瘤生長至可測量尺寸需要較長時間，而某些人源性腫瘤細(xì)胞系在動物模型中亦無腫瘤源性。
?
近來，整合有生物熒光報告載體的基因工程腫瘤細(xì)胞系及新型光學(xué)成像技術(shù)的出現(xiàn)，使對移植瘤的測量可在其未明顯成形時即可進行，而如加入特定轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)元件，則可進一步監(jiān)測由該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的信號通路，也可通過基因工程技術(shù)使熒光蛋白直接對特定分子過程起反應(yīng)，該類技術(shù)大大增強了對腫瘤形成及演化過程中信號通路的“非侵入式”分子成像監(jiān)測能力。
?
體內(nèi)中空纖維測試法（HFA）是由美國國家腫瘤研究所研制的一種抗腫瘤藥物體內(nèi)活性預(yù)篩選技術(shù)，操作時，將腫瘤細(xì)胞封裝入半透性中空纖維膜內(nèi)腔，然后再將纖維植入實驗動物皮下或腹膜，對實驗動物進行給藥處理后，取出纖維，測試細(xì)胞活性（MTT實驗），也可進行流式細(xì)胞、組織學(xué)及Western Blot分析。中空纖維測試法隨不能完全替代移植瘤模型，因傳統(tǒng)認(rèn)為其不能完整體現(xiàn)宿主動物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長及其與宿主組織之間的復(fù)雜互作過程，且腫瘤的生長受纖維的“幾何空間”限制，但與移植瘤技術(shù)相比，其仍具有諸多優(yōu)勢：1）回收細(xì)胞不受宿主細(xì)胞“污染”，有利后續(xù)分析；2）評估時間縮短，減少待測化合物用量；3）植入量或宿主動物體重?zé)o顯著變化；4）無細(xì)胞類型限制，即可評估無腫瘤源性細(xì)胞；5）可進行“多重”分析，單個動物可植入多根纖維，每根纖維可含不同類型細(xì)胞，即可同時評估某一化合物對多種細(xì)胞系的體內(nèi)活性。
?
本文旨在將體內(nèi)中空纖維測試法與體內(nèi)細(xì)胞成像技術(shù)相結(jié)合，從而快速、準(zhǔn)確評估抗腫瘤藥物的體內(nèi)活性。實驗顯示，纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞與周圍宿主組織存在相互作用，且用藥后可立即評估藥物對腫瘤細(xì)胞的影響，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)特定信號通路的激活也可通過該技術(shù)研究。
?
實驗
?
實驗使用多烯紫杉醇及伊立替康為模式藥物，MAT B III 大鼠乳腺癌細(xì)胞及MCF7乳腺癌細(xì)胞為測試細(xì)胞，并經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，使其高表達熒光素酶。
?
HFA實驗使用改良聚偏氟乙烯（mPVDF）中空纖維，纖維外徑1.2mm、內(nèi)徑1mm、MWCO 500kD，裝入細(xì)胞，每個1.5cm熱密封，在熱密封處剪斷。內(nèi)含細(xì)胞的中空纖維在6孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后，使用11G套管針從頸部切口植入裸鼠皮下。實驗同時建立皮下移植瘤模型，作為對照。
?
實驗使用近紅外熒光標(biāo)記血池探針結(jié)合熒光成像系統(tǒng)監(jiān)測植入中空纖維裸鼠體內(nèi)的血管生成情況，同時通過免疫組織化學(xué)檢測CD31表達。
?
未評估抗腫瘤藥物多烯紫杉醇和伊立替康的體內(nèi)活性，對植入含腫瘤細(xì)胞中空纖維的裸鼠進行給藥處理，腹腔注射D-熒光素15min后，每隔5min采集熒光圖像并分析。此外，為研究體內(nèi)核因子кB（NFкB）激活，裸鼠腹腔注射脂多糖（LPS）或腫瘤壞死因子α（TNF-α），并于D-熒光素注射后獲取熒光圖像。
?
結(jié)果
?
實驗檢測了體外/內(nèi)中空纖維內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)生物熒光強度與細(xì)胞數(shù)量線性相關(guān)，且纖維體內(nèi)注入一周后，纖維內(nèi)細(xì)胞快速增殖，與移植瘤生長速度相當(dāng)。如以實驗?zāi)[瘤細(xì)胞系為例，HFA可用于監(jiān)測纖維植入10d內(nèi)的腫瘤細(xì)胞生長，而在移植瘤模型中，此時腫瘤尺寸尚不可測量。
?
?
?
圖1. 中空纖維內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖。A）植入不同腫瘤細(xì)胞數(shù)量的裸鼠生物熒光成像； B）單個裸鼠植入腫瘤細(xì)胞后的生物熒光時間變化圖像；
?
圖2. 靜脈注射血池探針后24h的熒光圖像。
?
?
盡管HFA不能完整體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與宿主組織之間的相互作用，但某些過程也可以此檢測。實驗檢測了中空纖維植入部位鄰近組織的血管生成情況。結(jié)果顯示，植入后6d起，可檢測到熒光信號，但之后，植入無細(xì)胞纖維對照組的信號逐漸降低，而植入含細(xì)胞纖維實驗組的信號可繼續(xù)維持兩周，同時免疫組織化學(xué)分析顯示纖維外具有較強的CD31 免疫反應(yīng)。
圖3. 多烯紫杉醇和伊立替康給藥后熒光變化圖。
?
?
實驗使用兩種商品化抗腫瘤藥物作為HFA模式藥物，結(jié)果顯示，在植入MAT III細(xì)胞的實驗中，兩者均可抑制中空纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖，且生物熒光成像檢測顯示，用藥后12d，細(xì)胞數(shù)量降低約50%。而在MCF7細(xì)胞實驗中，以獲得相似結(jié)果。
圖4. LPS給藥前后生物熒光變化圖。
?
?
此外，在使用體內(nèi)中空纖維/光學(xué)報告細(xì)胞系模型檢測化合物對特定信號通路作用的實驗中，構(gòu)建了報告轉(zhuǎn)錄因子NFкB活性的細(xì)胞（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NFкB反應(yīng)元件驅(qū)動性熒光素酶）。裸鼠腹腔注射LPS后成像檢測，結(jié)果顯示LPS注射后，NFкB報告細(xì)胞生物熒光顯著增強。實驗同時使用TNF-α進行驗證，獲得相似結(jié)果。
?
討論
?
HFA操作步驟包括短期體外細(xì)胞培養(yǎng)、纖維體內(nèi)植入及短期藥物體內(nèi)效力評估，后續(xù)研究需從小鼠體內(nèi)取出纖維。本文將此方法與光學(xué)成像技術(shù)相結(jié)合，從而提供了一種以HFA為基礎(chǔ)的非侵害式體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長評估方法。
?
中空纖維光學(xué)成像可對腫瘤細(xì)胞進行中期（持續(xù)數(shù)周）評估，在此期間，纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞可與宿主組織相互作用，這點可由纖維周圍組織內(nèi)的血管生成進行驗證，光學(xué)成像和組織學(xué)研究都觀察到了相同的結(jié)果，其原因可能是腫瘤細(xì)胞分泌了促血管生成因子，后者從纖維內(nèi)滲出，從而促進新血管形成，而血管生成又為纖維內(nèi)細(xì)胞補給氧和營養(yǎng)物質(zhì)，維持其生長和增殖。
?
中空纖維體內(nèi)成像技術(shù)可用于新型抗腫瘤藥物的快速、精確篩選，與傳統(tǒng)移植瘤模型相比，非侵害式生物熒光成像技術(shù)可對纖維植入后數(shù)天內(nèi)的細(xì)胞增殖情況進行監(jiān)測。實驗使用多烯紫杉醇伊立替康對該模型進行了驗證，結(jié)果顯示，給藥后4d即可顯著抑制纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長。此外，所用纖維的MWCO為500kD，所以該技術(shù)可推廣用于評估其它小分子、抗體或siRNA治療的效力。
?
同時，實驗通過評估NFкB信號，證實HFA可用于研究細(xì)胞內(nèi)分子途徑。與在正常小鼠組織內(nèi)檢測NFкB活性的轉(zhuǎn)基因小鼠模型相比，HFA可在人及小鼠/大鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速評估NFкB活性，即該模型可用于測試NFкB抑制劑，如小分子或多肽。同理，如制備整合其它通路依賴性光學(xué)報告基因的細(xì)胞系，即可使用HFA模型對分子通路進行監(jiān)測。
?
綜上所述，對含有表達光學(xué)信號基因腫瘤細(xì)胞的中空纖維進行體內(nèi)成像，可對抗腫瘤藥物進行初步體內(nèi)活性篩選，該技術(shù)無需等待腫瘤成形，可回收未被宿主細(xì)胞“污染”的腫瘤細(xì)胞以進行進一步分析，且無細(xì)胞類型限制。構(gòu)建可表達光學(xué)報告基因的腫瘤細(xì)胞，方便了細(xì)胞植入后的非侵害式、可重復(fù)成像監(jiān)測，也可用于監(jiān)測特定分子通路，而一個實驗動物可植入數(shù)根纖維，即可平行研究化合物對數(shù)個通路的選擇性作用。
?
文獻來源：
Zhang, G., Chen, T., Bednar B., et al., Optical Imaging of Tumor Cells in Hollow Fibers: Evaluation of the Antitumor Activities of Anticancer Drugs and Target Validation. Neoplasia, 2007, 9(8):652-661.
點擊查看詳細(xì)內(nèi)容：中空纖維測試法結(jié)合細(xì)胞光學(xué)成像：抗腫瘤藥物活性評估和靶標(biāo)驗證