M.?Kenrick,?S.?Hancock,?S.?Stubbs,?and?N.?Thomas
GE?Healthcare,?The?Maynard?Centre,?Cardiff,?UK
?
?
近來(lái)關(guān)于siRNA技術(shù)和諸如IN?Cell?Analyzer的高通量成像分析平臺(tái)的發(fā)展對(duì)于基因組和蛋白組的功能分析起著革命性的推動(dòng)作用。在此，我們將會(huì)介紹兩種能夠穩(wěn)定表達(dá)綠熒光蛋白（GFP）細(xì)胞周期感受器的細(xì)胞株在篩選siRNA分子庫(kù)中的應(yīng)用，這種篩選得到的分子庫(kù)將被用于抑制細(xì)胞周期的核心調(diào)控基因。通過(guò)全自動(dòng)的圖像分析系統(tǒng)對(duì)這兩種細(xì)胞株的中GFP熒光強(qiáng)度和分布狀態(tài)進(jìn)行成像檢測(cè)，得到熒光在細(xì)胞周期各個(gè)過(guò)程中的分布，該結(jié)果能夠幫助科學(xué)家篩選通過(guò)封閉細(xì)胞周期起作用的藥物。???
?
介紹
?
合成和病毒編碼的siRNA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了一個(gè)新的高度(1,?2)，大量的RNAi篩選已經(jīng)能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞?(3–5)。除了保證有大量有效的siRNA外，高效的哺乳動(dòng)物siRNA功能篩選更加需要高信息含量的系統(tǒng)模式，從而使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中能夠提取的多重參數(shù)通量水平和巨大的研究課題數(shù)量相一致。
?
可喜的是，熒光成像系統(tǒng)和分析軟件的發(fā)展已經(jīng)跟上了siRNA的發(fā)展速度，目前的技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)罴?xì)胞形態(tài)發(fā)生進(jìn)行高通量的成像和分析(6,?7)。相應(yīng)的儀器能夠通過(guò)整合熒光細(xì)胞感受器和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的數(shù)據(jù)，提供在細(xì)胞篩選中siRNA的詳細(xì)表性變化信息，從而對(duì)復(fù)雜多變的生物系統(tǒng)進(jìn)行研究。
?
在本研究中，我們研究了兩種能夠穩(wěn)定表達(dá)綠熒光蛋白（GFP）細(xì)胞周期感受器的細(xì)胞株(8–10)，它們能被用來(lái)篩選抑制細(xì)胞周期核心調(diào)控基因的siRNA分子庫(kù)(圖?1)。
?
siRNA?篩選
?
使用包含112個(gè)siRNA庫(kù)的Dharmacon?siARRAY?對(duì)細(xì)胞周期基因進(jìn)行敲除，其中每個(gè)庫(kù)都包括了能夠抑制單一細(xì)胞周期相關(guān)基因4種siRNA，并把隨機(jī)編碼和用Cy?5標(biāo)記的siRNA作為對(duì)照以確定轉(zhuǎn)染效率。siRNA轉(zhuǎn)染至G2/M和G1/S細(xì)胞周期階段標(biāo)記（Cell?Cycle?Phase?Marker?，CCPM）的細(xì)胞并于U2OS細(xì)胞表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法的詳細(xì)描述可參考本文的完整版。
?
細(xì)胞成像使用GE?Healthcare的IN?Cell?Analyzer?1000，20倍物鏡，475BP20/535BP50?(GFP)?和
620BP60/700BP75?(DRAQ5)?激發(fā)/散射濾光片。得到的圖像數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換成IN?Cell?Analyzer?3000的數(shù)據(jù)格式，并通過(guò)圖像對(duì)細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行了分析。
?
結(jié)果
?
通過(guò)對(duì)G1/S?CCPM細(xì)胞的分析，得到了在G1至S期過(guò)程中，敲除剪切型細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin?E的影響性的精確定量。對(duì)照的G1/S?CCPM細(xì)胞表現(xiàn)出的可分解的細(xì)胞比率(76%)和對(duì)照的G2/M?CCPM細(xì)胞相一致(74%)，其中9%為G1期細(xì)胞，67%為S期細(xì)胞。敲除了cyclin?E后，在G1和S期的相關(guān)細(xì)胞總體比率仍舊維持在76%，同樣的結(jié)果也在G2/M?CCPM細(xì)胞中被觀察到。然而，值得注意的是這兩個(gè)時(shí)期之間的平衡卻發(fā)生了變化，G1期細(xì)胞升高至27%，S期細(xì)胞降低為49%，這揭示了cyclin?E在細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用。
?
先前的研究表明，用siRNA敲除polo-like激酶（PLK）能夠抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停留在有絲分裂階段，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(11)。用抑制PLK的siRNA處理G2/M?CCPM細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)用50?nM?siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，有絲分裂的細(xì)胞數(shù)目發(fā)生了明顯的增加(圖3B)。通過(guò)對(duì)G1/S?CCPM?(圖3A)?和G2/M?CCPM（數(shù)據(jù)未給出）的分析證實(shí)了細(xì)胞對(duì)PLK被敲除后的極度敏感性，在5?nM?siRNA處理下，G2和M期的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了增長(zhǎng)，相應(yīng)的，G1期細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了下降。
?
使用DNA粒度對(duì)所有通過(guò)siRNA庫(kù)篩選得到的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行再次分析，結(jié)果表明PLK?siRNA在本研究中對(duì)于敲除基因從而誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程起著最為重要的作用(圖3C)。??
?
結(jié)論?
?
--通過(guò)siRNA對(duì)敏感和動(dòng)態(tài)的細(xì)胞表型研究進(jìn)行干擾，為細(xì)胞周期的功能分析提供了強(qiáng)有力的工具。
--高通量亞細(xì)胞成像和全自動(dòng)多重參數(shù)圖像分析為篩選和研究siRNA的基因敲除作用提供了一個(gè)高內(nèi)涵的分析環(huán)境。
圖1.?G2/M?和?G1/S?細(xì)胞周期階段標(biāo)記(CCPM)構(gòu)建和細(xì)胞株.?在設(shè)計(jì)好的細(xì)胞周期對(duì)照及應(yīng)答原理的調(diào)控下，GFP融合蛋白的表達(dá)、定位和降解為在活細(xì)胞的周期中定位蛋白提供了可能。cyclin?B1啟動(dòng)子在S期晚期啟動(dòng)EGFP表達(dá)，并由此調(diào)控表達(dá)G2/M?CCPM。當(dāng)細(xì)胞周期到達(dá)G2期時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的EGFP信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)，而細(xì)胞周期早期熒光信號(hào)主要集中在核上。GFP信號(hào)在有絲分裂期強(qiáng)度達(dá)到最大值，隨即由于cyclin?B1破壞盒(D-box)的調(diào)控而迅速下降，于是在下面的2個(gè)G1期子細(xì)胞上就得不到熒光信號(hào)。G1/S?CCPM通過(guò)泛素C啟動(dòng)子的作用而表達(dá)，在整個(gè)細(xì)胞周期中GFP融合蛋白的表達(dá)水平都較低。在G1期，融合蛋白大都位于細(xì)胞核中，在進(jìn)入S期過(guò)程中，PSLD區(qū)域的磷酸化作用介導(dǎo)蛋白向細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)，從而在G2期整體改變了融合蛋白在細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)中的分布。
??
?
圖2.?Cyclin?E?siRNA阻斷了G1期向S期的變化。用直接抑制cyclin?E的siRNA?pool轉(zhuǎn)染G1/S?CCPM細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24小時(shí)后，以BrdU刺激細(xì)胞1小時(shí)，通過(guò)細(xì)胞增殖熒光法檢測(cè)BrdU的整合作用。G1和S期的細(xì)胞通過(guò)用目標(biāo)密度圖像分析進(jìn)行數(shù)量測(cè)定。G1期細(xì)胞為綠色，S期細(xì)胞為紅色。
??
?
圖3.?以PLK?siRNA阻斷細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡。（A）5?nM?PLK?siRNA?轉(zhuǎn)染G1/S?CCPM細(xì)胞，孵育24小時(shí)后加入BrdU。（B）50?nm?PLK?siRNA轉(zhuǎn)染G2/M?CCPM細(xì)胞并孵育48小時(shí)。（C）對(duì)于所有使用的siRNA，通過(guò)檢測(cè)DNA的粒度來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)
1.?Kumar,?R.?Conklin?DS,?Mittal?V.?High-throughput?selection?of?effective?RNAi?probes?for
gene?silencing.?Genome?Res.?13?(10),?2333–2340?(2003).
2.?Luo,?B.?et?al.?Small?interfering?RNA?production?by?enzymatic?engineering?of?DNA
(SPEED).?Proc.?Natl.?Acad.?Sci.?USA?101?(15),?5494–5499?(2004).
3.?Berns,?K.?et?al.?A?large-scale?RNAi?screen?in?human?cells?identifies?new?components?of
the?p53?pathway.?Nature?428?(6981),?431–437?(2004).
4.?Paddison,?P.J.?et?al.?A?resource?for?large-scale?RNA-interference-based?screens?in
mammals.?Nature?428?(6981),?427–431?(2004).
5.?Mousses,?S.?et?al.?RNAi?microarray?analysis?in?cultured?mammalian?cells.?Genome
Res.?13?(10),?2341–2347?(2003).
6.?Ramm,?P.?and?Thomas,?N.?Image-based?screening?of?signal?transduction?assays.
Sci.?STKE.?(177),?(2003).
7.?Price,?J.H.?et?al.?Advances?in?molecular?labeling,?high-throughput?imaging?and?machine?intelligence?portend?powerful?functional?cellular?biochemistry?tools.
J.?Cell.?Biochem.?Suppl.?39,194–210?(2002).
8.?Thomas,?N.?Lighting?the?circle?of?life:?fluorescent?sensors?for?covert?surveillance?of?the
cell?cycle.?Cell?Cycle?2?(6),?545–549?(2003).
9.?Thomas,?N.?et?al.?Characterization?and?gene?expression?profiling?of?a?stable?cell?line
expressing?a?cell?cycle?GFP?sensor.?Cell?Cycle?4?(1),?191–195?(2005).
10.?Gu,?J.?et?al.?Cell?cycle-dependent?regulation?of?a?human?DNA?helicase?that?localizes
in?DNA?damage?foci.?Mol.?Biol.?Cell.?(7),?3320–3332?(2004).
11.?Liu,?X.?and?Erikson,?R.L.?Polo-like?kinase?(Plk)1?depletion?induces?apoptosis?in?cancer
cells.?Proc.?Natl.?Acad.?Sci.?USA?100?(10),?5789–5794?(2003).
關(guān)于 GE?Healthcare 的 IN?Cell?Analyzer
IN?Cell?Analyzer?是運(yùn)用了當(dāng)今最先進(jìn)的模塊化快速自動(dòng)成像技術(shù)的高內(nèi)涵活細(xì)胞分析系統(tǒng)，其高度靈敏的成像技術(shù)使得科學(xué)家們能夠輕松地研究細(xì)胞變化過(guò)程中的真實(shí)生物學(xué)進(jìn)程，目前，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域。該系統(tǒng)將高通量的自動(dòng)顯微鏡技術(shù)、在線自動(dòng)加樣技術(shù)和在線細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)完美整合，是當(dāng)前功能最強(qiáng)大、應(yīng)用最廣泛、設(shè)計(jì)最靈活、操作最簡(jiǎn)便的高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)。其主打機(jī)型IN?Cell?Analyzer?1000?獲得全球權(quán)威咨詢機(jī)構(gòu)Frost?&?Sullivan頒發(fā)的2007年細(xì)胞分析領(lǐng)域?-?技術(shù)革新獎(jiǎng)。希望獲取更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)http://www.gehealthcare.com/incell。
?