在含有DOPC的系統(tǒng)中，當(dāng)DLin-MC3-DMA的量增加時(shí)，DOPC的擴(kuò)散以及DLin-MC3-DMA的擴(kuò)散都會(huì)減慢。 在含有 DOPE 的系統(tǒng)中，添加DLin-MC3-DMA比含有 DOPC的膜更顯著地降低了兩種脂質(zhì)的擴(kuò)散。 這可以被認(rèn)為是含有 DLin-MC3-DMA 和 DOPE的 LNP 在質(zhì)粒 DNA 遞送中沒(méi)有表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染效率的原因，因?yàn)樵贒NA遞送過(guò)程中，橫向擴(kuò)散和膜融合是重要的因素。
表3 脂質(zhì)體大小以及膜厚度
System | 脂質(zhì)體面積 | 膜厚度 |
DOPC+5%DLin-MC3-DMA | 70.98 ± 0.3 | 33.9 ± 0.1 |
DOPC+15%DLin-MC3-DMA | 73.01 ± 0.3 | 33.1 ± 0.1 |
DOPE+5%DLin-MC3-DMA | 63.52 ± 0.3 | 37.0 ± 0.1 |
DOPE+15%DLin-MC3-DMA | 68.46 ± 0.4 | 33.7 ± 0.1 |
DOPC（pure） | 69.00 ± 1.2 | 35.6 ± 0.1 |
DOPE（pure） | 63.35 ± 1.0 | 38.2 ± 0.1 |
根據(jù)該表，含有DOPC的膜比含有DOPE的膜具有更高的脂質(zhì)體面積。 隨著DLin-MC3-DMA摩爾比的增加，每個(gè)脂質(zhì)的平均面積也會(huì)增加。 在使用DOPE的體系中，與純膜相比，每個(gè)脂質(zhì)的平均面積增長(zhǎng)高于使用DOPC的系統(tǒng)。 然而，表3中的值對(duì)于每個(gè)脂質(zhì)頭部基團(tuán)并不精確，因?yàn)镈Lin-MC3-DMA的脂質(zhì)尾部可能出現(xiàn)在表面，并且在某些幀中，整個(gè)陽(yáng)離子脂質(zhì)可能位于膜的中心，而不出現(xiàn)在雙層表面。 可以從每個(gè)脂質(zhì)的面積值得出的結(jié)論是，模擬框在DLin-MC3-DMA摩爾比為15 %時(shí)變得更寬。
圖4. 質(zhì)量密度分布圖：(a) DOPC 和 (b) DOPE。 “Pure”代表僅含有磷脂的脂質(zhì)雙層，+5% DLin-MC3-DMA 意味著它是5%的MC3，+15% DLin-MC3-DMA 意味著它是 15% 的MC3.
圖4展示了模擬系統(tǒng)以及含有純磷脂的脂質(zhì)雙層的質(zhì)量密度分布。 隨著 DLin-MC3-DMA 濃度的增加，圖中 (a) 和 (b) 部分都表現(xiàn)出相同的質(zhì)量密度峰值向雙層中心移動(dòng)的趨勢(shì)。 這可以解釋為雙層變薄，因?yàn)橘|(zhì)量密度的最高值與脂質(zhì)頭部集團(tuán)的位置有關(guān)（計(jì)算的膜厚度值見(jiàn)表3）。 然而，為了獲得脂質(zhì)分子各個(gè)部分所在位置的準(zhǔn)確圖片，應(yīng)計(jì)算這些部分對(duì)質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。
圖 5 質(zhì)量密度分布：（a）DOPC 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（b）DOPE 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（c）DOPC 和 15% 的 DLin-MC3- DMA 和 (d) DOPE 和 15% 的 DLin-MC3-DMA。粉紅色區(qū)域顯示磷脂的 PO4 頭部基團(tuán)的位置。 DLin-MC3-DMA (h) 和 DLin-MC3-DMA (t) 分別表示脂質(zhì)的頭部和尾部。在表示 DLin-MC3-DMA 結(jié)構(gòu)的圖像上，用于計(jì)算部分分子質(zhì)量密度的部分用紅色圓圈表示。為了獲得“可比較”的輪廓，僅從頭組中取出氮和兩個(gè)碳進(jìn)行計(jì)算，而從尾組中取出帶有氫的碳進(jìn)行計(jì)算。從圖中磷脂的結(jié)構(gòu)來(lái)看，PO4-基團(tuán)被認(rèn)為是脂質(zhì)頭部基團(tuán)的代表，而尾部則用尾部末端的CH3-基團(tuán)表示。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色 - 氫，深灰色 - 碳，藍(lán)色 - 氮和紅色 - 氧。黑色虛線表示 PO4 基團(tuán)質(zhì)量密度的最大值點(diǎn)。
圖5顯示了兩種脂質(zhì)的頭部和尾部對(duì)質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。在DLin-MC3-DMA的最低濃度 (5 mol%) 可以觀察到兩種磷脂的分布差異（圖 5（a）和（b））：DLin-MC3-DMA 尾部的峰位置位于DOPE頭部區(qū)域，而在DOPC的情況下，該峰出現(xiàn)在磷脂尾部區(qū)域。 DLin-MC3-DMA的頭部基團(tuán)“更喜歡”位于 DOPC 和 DOPE 膜中的磷脂頭之間。
當(dāng)DLin-MC3-DMA的量為 15 mol%（圖 5（c）和（d））時(shí)，DLin-MC3-DMA 尾部的峰移到 DOPE 頭部基團(tuán)的區(qū)域外。在 DOPC 膜中，與含有 5 mol% 胺脂的脂雙層相比，該峰的位置沒(méi)有改變。此外，與含有 DOPE 的脂質(zhì)雙層相比，位于 DOPC膜中心的DLin-MC3-DMA尾部數(shù)量更多。DLin-MC3-DMA的頭部“更喜歡”位于磷脂頭部的區(qū)域，但在含有 DOPC 的膜中，即使在脂雙層的中心也檢測(cè)到少量。 DLin-MC3-DMA 的這種位置與 Ramenzapour等人在模擬 DLin-KC2-DMA 以及POPC 和膽固醇，處于中性 pH 值下觀察到的位置略有相似。
然而，脂質(zhì)并不是模擬系統(tǒng)中存在的唯一分子。由于它們的運(yùn)動(dòng)，水的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到影響。水也可以滲透膜。在純磷脂雙層中，在雙層中心沒(méi)有檢測(cè)到大量的水，但DLin-MC3-DMA的添加改變了膜的滲透。例如，5 mol% 的量使 DOPE 脂質(zhì)膜具有滲透性，而在 DOPC 的情況下，滲透性更可忽略不計(jì)。在較高濃度的 DLin-MC3-DMA (15 mol%) 情況下，情況正好相反，含有DOPC的雙層的水滲透率高于含有 5 mol% 胺脂質(zhì)時(shí)的水滲透率，而對(duì)于含有 DOPE 的膜雙層中心水的質(zhì)量密度幾乎為零。
這些發(fā)現(xiàn)表明，在 DLin-MC3-DMA 的最低濃度下，脂質(zhì)尾部甲基的質(zhì)量密度峰值出現(xiàn)在 PO4 基團(tuán)區(qū)域內(nèi)（圖 5（b））。這種少量疏水部分的位置可能是質(zhì)子轉(zhuǎn)移中斷的原因，因?yàn)樵诩兞字p層中，根據(jù) Br?ndén 等人和 Yamashita 等人的說(shuō)法，磷酸基團(tuán)具有“質(zhì)子收集效應(yīng)”此外，磷脂酰膽堿頭部基團(tuán)周?chē)乃肿优c磷脂酰乙醇胺頭部基團(tuán)周?chē)乃肿記](méi)有相同的優(yōu)先取向。因此，與具有 DOPC 的脂質(zhì)雙層相比，外來(lái) CH3 基團(tuán)的存在更能導(dǎo)致 DOPE 膜中的孔形成。
在含有 DOPC 的脂質(zhì)雙層中，當(dāng)含有 15 mol% 時(shí)，隨著DLin-MC3-DMA濃度的增加，水滲透率略高。這與少量 DLin-MC3-DMA 的頭部基團(tuán)位于由DOPC組成的膜的中心有關(guān)（圖 5（c））。這些頭部基團(tuán)可以起到水分子通過(guò)膜的“轉(zhuǎn)運(yùn)體”的作用。在含有等量 DLin-MC3-DMA 的DOPE的脂質(zhì)雙層中，水滲透的降低可以通過(guò) DLin-MC3-DMA 脂質(zhì)尾部位置的輕微變化來(lái)解釋。DLin-MC3-DMA的甲基最大質(zhì)量密度分布向 DOPE 的羰基轉(zhuǎn)移，這可以在該區(qū)域產(chǎn)生疏水層并防止水進(jìn)入膜。
我們只能推測(cè)這些關(guān)于分子不同部分對(duì)質(zhì)量密度的影響，在較高濃度的DLin-MC3-DMA下緩慢的橫向擴(kuò)散可能與強(qiáng)相互作用有關(guān)，也可能與磷脂的頭部基團(tuán)有關(guān)。特別是，在具有 DOPE脂質(zhì)尾部的膜中，DLin-MC3-DMA似乎與磷脂頭部相關(guān)聯(lián)。為了闡明這一點(diǎn)，我們計(jì)算了兩個(gè)組分之間的徑向分布函數(shù)（RDF）。
圖 6 磷脂和 DLin-MC3-DMA 頭部基團(tuán)中原子對(duì)之間的 RDF。 (a) 來(lái)自 DLin-MC3-DMA 的氧與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。 (b) 來(lái)自 DLin-MC3-DMA 的氧與來(lái)自 DOPC/DOPE 中甘油基團(tuán)的 CH2 基團(tuán)的氫之間的 RDF。 部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍(lán)色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍(lán)色-氮和紅色-氧。
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圖 7 磷脂頭部和DLin-MC3-DMA尾部原子對(duì)之間的RDF。（a）DLin-MC3-DMA中標(biāo)記為“a”的碳與來(lái)自DOPC的CH3基團(tuán)的氫/來(lái)自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。 (b) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“b”的碳與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(c) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“c”的碳與來(lái)自 DOPC 的CH3基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(d) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“d”的碳與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍(lán)色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。DLin-MC3-DMA的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍(lán)色-氮和紅色-
2020年12月9日，PCCP（phys.chem.chem.phys）期刊發(fā)表文章《DOPC versus DOPE as a helper lipid for gene-therapies: molecular dynamics simulations with DLin-MC3-DMA》[1]。該文章使用分子模擬手段分析使用同一種陽(yáng)離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA與兩種不同的輔助磷脂（DOPC和DOPE）構(gòu)建兩種脂質(zhì)體體系進(jìn)行模擬。分析兩種合成磷脂形成的脂質(zhì)體差異。為將來(lái)理性化設(shè)計(jì)脂質(zhì)體提供可行性。
摘要：
可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是基因治療遞送系統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 的重要組成成分。 DLin-MC3-DMA 是最有前途的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)（或胺脂質(zhì)）之一。根據(jù)它們?cè)谒幬镏械膽?yīng)用，在包裹核酸的LNP中還包含各種輔助脂質(zhì)，例如磷酸化和聚乙二醇化脂質(zhì)、膽固醇等。由于其復(fù)雜的成分，這些基因療法中應(yīng)用的LNP結(jié)構(gòu)改進(jìn)較為困難，并且尚未確定每種脂質(zhì)在LNP的藥理作用。在這項(xiàng)工作中，構(gòu)建了DLin-MC3-DMA中性形式的原子模型，并進(jìn)行了全原子模型行下的分子動(dòng)力學(xué) (MD) 模擬，以研究LNP中合成磷脂頭部基團(tuán)對(duì)細(xì)胞膜可能存在的影響。在中性條件下（ pH = 7.4）構(gòu)建并模擬了含有兩種不同摩爾比的 DLin-MC3-DMA（5%和15%）的DOPC及DOPE 脂質(zhì)的雙層。MD軌跡分析結(jié)果顯示DOPE脂質(zhì)頭部基團(tuán)與DLin-MC3-DMA尾部密切相關(guān)，而DOPC脂質(zhì)的頭部基團(tuán)未觀察到這種顯著關(guān)聯(lián)。此外，DOPE和DLin-MC3-DMA之間較強(qiáng)的聯(lián)系導(dǎo)致DLin-MC3-DMA固定在膜表面。脂質(zhì)之間的相互作用減慢了兩個(gè)雙層膜體系的橫向擴(kuò)散，其中在含有DOPE的體系中觀察到擴(kuò)散速率的降低更為顯著。這也解釋利用磷脂酰乙醇胺構(gòu)建的脂質(zhì)體雙層膜（DOPE/DLin-MC3-DMA）具有較低的水滲透性，并且可能與其較差的轉(zhuǎn)染特性有關(guān)。
圖1：分子動(dòng)力學(xué)模擬的脂質(zhì). (a) DLin-MC3-DMA. (b) 構(gòu)建DLin-MC3-DMA力場(chǎng)參數(shù)的部分. (c) DOPC,18:1 (Δ9 – cis) PC. (d) DOPE, 18:1(Δ9 – cis) PE.
模擬方法：
1. DLin-MC3-DMA模型的參數(shù)化
DLin-MC3-DMA模型參數(shù)的構(gòu)建參考了多不飽和磷脂相同的原理，由于LNP周?chē)沫h(huán)境通常為中性，因此設(shè)置總電荷為零以模擬中性條件下的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)的模型，MD模擬過(guò)程中并不會(huì)用到該化合物的電離狀態(tài)。
參考已有的用于多不飽和***的SLipids力場(chǎng)（FF）推導(dǎo)DLin-MC3-DMA的力場(chǎng)參數(shù)。SLipids FF的一般形式為：
EFF = Ebonded + Enon-bonded
Ebonded = Eangles + Edihedrals + Ebonds + EUrey–Bradley
Enon-bonded = ELennard-Jones + ECoulomb
本研究中，重點(diǎn)是計(jì)算陽(yáng)離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)的電荷以及二面體參數(shù)，而脂質(zhì)尾部的二面體參數(shù)可以直接調(diào)用SLipids FF中已知的不飽和脂質(zhì)中的參數(shù)，脂質(zhì)尾部的電荷參考已有電荷進(jìn)行略微調(diào)整即可。
由于DLin-MC3-DMA的全原子量化計(jì)算所需的時(shí)間較長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)內(nèi)存要求較高，為了便于計(jì)算，使用高斯gaussian09軟件，利用B3LYP方法，CC-pVTZ基組以及RESP靜電勢(shì)約束方法對(duì)DLin-MC3-DMA的等效小模型（圖1b）進(jìn)行了電荷計(jì)算。在IEFPCM模型中，脂質(zhì)體的頭部基團(tuán)被放置在介電常數(shù)為78.4的可極化連續(xù)體系中，模擬溶劑效應(yīng)以及對(duì)電荷分布的誘導(dǎo)極化。具體電荷參數(shù)可在support文件中查閱。
在計(jì)算出部分原子電荷后，參考之前的SLipids FF相同的原理推導(dǎo)出新的二面體參數(shù)。二面角參數(shù)可以在support文件圖S2中查閱。與多不飽和脂質(zhì)的力場(chǎng)參數(shù)一樣，原始分子使用二階M?ller–Plesset擾動(dòng)原理以及CC-pVDZ基組進(jìn)行優(yōu)化，在-180度到180度的區(qū)間里，設(shè)置10度為步長(zhǎng)，保持其他自由度不變，通過(guò)圍繞二面角旋轉(zhuǎn)優(yōu)化分子。為了計(jì)算不同角度的構(gòu)象下的相對(duì)量子力學(xué)能量，采取了相互作用能的混合方法（HM-IE），關(guān)系是為：
ECCSD(T)/BBS = ECCSD(T)/SBS + ECCSD(T)/BBS ? ECCSD(T)(SBS) ≈ ECCSD(T)/SBS + EMP2/BBS ? EMP2/SBS
其中MP2表示二階M?ller–Plesset擾動(dòng)原理，CCSD（T）是耦合簇理論中的耦合簇單雙和微擾三激發(fā)方法。SBS表示小基組（cc-pVDZ）,BBS表示大基組（cc-pVQZ）。
完成高階量子化學(xué)計(jì)算后，所得值可以利用如下方程擬合二面體勢(shì)：
Edihedral = (ECCSD(T)/BBS ? EMD) ? (ECCSD(T)/BBS ? EMD)min