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細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞衍生出的膜結(jié)構(gòu)囊泡，如外泌體、微囊泡和凋亡小體等。由于在囊泡腔內(nèi)包裹著或在顆粒表面修飾著豐富的成分，EVs在治療各類危及生命的疾病方面有巨大潛力。通常情況下，源于免疫細(xì)胞外泌體對腫瘤表現(xiàn)出不同的免疫治療效果。另外，由于其天然獨(dú)特的特性，EVs在藥物遞送方面表現(xiàn)出卓越的性能，包括但不限于固有穩(wěn)定性、生物膜透性、低免疫原性和歸巢能力。前人研究證明，裝載阿霉素的外泌體對乳腺癌細(xì)胞有靶向細(xì)胞毒性作用，且與游離藥物相比，心臟毒性和副作用更小。另外一個(gè)研究表明，裝載紫杉醇的外泌體對多藥耐藥肺癌有良好的治療效果。外泌體甚至能夠通過血腦屏障遞送藥物，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能的解決方案。除了有效的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果外，將外泌體作為藥物載體有著巨大的轉(zhuǎn)化潛力。源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體裝載KRAS G12D siRNA后對胰腺癌的治療效果正進(jìn)行Ⅰ期研究。盡管前景廣闊，但它們距離全面臨床轉(zhuǎn)化階段還很遠(yuǎn)。一個(gè)最重要的原因就是大多數(shù)EVs由于其納米直徑被保留在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，然后被單核巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞吸收。為了提高藥物遞送精度和減少副作用，在目標(biāo)組織處通過EVs釋放特定藥物非常可取，但具有挑戰(zhàn)性。

在過去的幾十年里，光動(dòng)力療法（PDT）由于其突出的優(yōu)勢，已成為癌癥治療的新模式，比如時(shí)空可控性、最小侵入性、高效性和低毒性。該療法已被證實(shí)對多種有效，且目前幾種光敏劑已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療某些癌癥。此外，該療法與其他治療方法結(jié)合，可進(jìn)一步提高治療效果（比如光熱療法、放射療法、免疫療法和基因療法）。PDT與PDL-1檢查點(diǎn)阻斷免疫療法的協(xié)同作用，不僅可以消除原發(fā)性腫瘤，而且可以觸發(fā)系統(tǒng)性的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，從而完全抑制未治療的轉(zhuǎn)移瘤。即便如此，PDT對深部腫瘤的治療效果受到激發(fā)光透性差、效率低的嚴(yán)重影響。作為一個(gè)有吸引力的替代方案，光敏劑通過原位化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)能的激發(fā)不受透性的限制。Yu等通過構(gòu)建基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的仿生納米反應(yīng)器，制定的光動(dòng)力-饑餓協(xié)同治療策略對深部轉(zhuǎn)移瘤表現(xiàn)出良好的治療效果。然而，由于化學(xué)能通常是H₂O₂與過氧草酸酯衍生物反應(yīng)產(chǎn)生的，此類化學(xué)激發(fā)PDT嚴(yán)重依賴于過氧化氫。盡管與正常組織相比，腫瘤微環(huán)境中的H₂O₂水平升高，但持續(xù)的反應(yīng)會(huì)迅速耗盡腫瘤組織局部的H₂O₂供應(yīng)，PDT的治療效果將明顯受限。為了提高化學(xué)激發(fā)的PDT效率，需要在腫瘤微環(huán)境中充分補(bǔ)充H₂O₂。然而，H₂O₂增強(qiáng)劑的可靠性以及增強(qiáng)劑與光敏劑(PSs)共同遞送到腫瘤的有效策略仍然十分有限。

該研究構(gòu)建了自激活自發(fā)光的EVs遞送系統(tǒng)，同時(shí)展示三種協(xié)同抗癌治療模式。源于M1巨噬細(xì)胞的EVs（M1 EVs）和雙[2,4,5-三氯-6-（戊氧羰基）苯基]草酸酯（CPPO），二氫卟酚e6（Ce6）共同孵育后，用多柔比星原藥aldoxorubicin（Dox-EMCH）進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，以獲得裝載CPPO、Ce6和Dox-EMCH的EVs（M1CCD）。系統(tǒng)給藥后，由于M1 EVs天然的靶向能力，制備的M1CCD在腫瘤中不斷積累，而M1 EVs有效地將促腫瘤的M2巨噬細(xì)胞重新誘導(dǎo)為抗腫瘤的M1巨噬細(xì)胞，不僅表現(xiàn)出免疫治療活性，而且產(chǎn)生H₂O₂。CPPO與增多的H₂O₂反應(yīng)，產(chǎn)生的化學(xué)能在沒有光激發(fā)的情況下直接激活光敏劑Ce6，產(chǎn)生用于成像的化學(xué)發(fā)光和用于PDT的單線態(tài)氧（¹O₂）。與此同時(shí)，由¹O₂引起的膜破裂導(dǎo)致前藥Dox-EMCH釋放，隨后在酸性微環(huán)境中被迅速激活轉(zhuǎn)化為毒性阿霉素（Dox），并滲透到腫瘤深部的低氧組織。免疫療法，光動(dòng)力療法和化學(xué)療法的協(xié)同作用產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗癌效果和較小的副作用。這種智能工程化的EV遞送系統(tǒng)作為癌癥治療候選方案非常有前景。

基本信息

摘 要

細(xì)胞外囊泡（EVs）在疾病治療和藥物遞送方面都具有巨大潛力。然而，準(zhǔn)確地從細(xì)胞外囊泡釋放藥物，以及細(xì)胞外囊泡和藥物在目標(biāo)組織處的自發(fā)治療效果協(xié)同作用仍然具有挑戰(zhàn)性。本研究報(bào)道了一種工程化的自激活光-EV，用于協(xié)同三模式抗癌治療。M1巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（M1 EVs）同時(shí)裝載CPPO，Ce6和Dox-EMCH。給藥后，由于M1 EVs的腫瘤歸巢能力，制備的該系統(tǒng)可主動(dòng)靶向腫瘤，其中M1 EVs將M2重新極化為M1巨噬細(xì)胞，不僅顯示出免疫療法的作用，而且進(jìn)一步提高腫瘤微環(huán)境中的H₂O₂。H₂O₂和CPPO之間發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)能，激活Ce6，產(chǎn)生用于成像的化學(xué)發(fā)光和用于PDT的¹O₂。同時(shí)，由¹O₂引起的膜破裂導(dǎo)致Dox-EMCH釋放，被釋放的Dox-EMCH隨后被特異性激活并滲透到腫瘤的低氧組織。免疫療法，光動(dòng)力療法和化學(xué)療法的協(xié)同作用可產(chǎn)生有效的抗癌功效，顯示出抗擊癌癥的巨大希望。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. M1CCD具有自激活化學(xué)發(fā)光和¹O₂生成能力

小鼠原始腹腔巨噬細(xì)胞首先用1ug/mL脂多糖（LPS）處理24小時(shí)極化形成M1巨噬細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)確定極化效果。隨后用經(jīng)驗(yàn)證的超速離心程序純化M1 EVs。EVs的磷脂雙分子層通過疏水作用將CPPO和Ce6包裹起來，形成的親水管腔裝載水溶性的Dox-EMCH。為了裝載盡可能多的藥物，首先，作者分別研究了M1 EVs（約10¹⁰細(xì)胞顆粒mL^-1）中CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載能力，發(fā)現(xiàn)裝載飽和濃度分別為100、160和250 ug/mL。然后將相同數(shù)目的M1 EVs（約10¹⁰細(xì)胞顆粒mL^-1）用100 ug/mL的CPPO和160 ug/mL的Ce6孵育，用250 ug/mL的Dox-EMCH進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。通過CPPO、Ce6和Dox-EMCH紫外吸收光譜的特征吸收峰及其標(biāo)志物的熒光成像效果驗(yàn)證這些藥物是否成功裝載（圖2a,b）。每1×10¹⁰M1 EVs顆粒（n=6）CPPO、Ce6和Dox-EMCH的裝載量分別為16.7±0.8,5.4±0.3,12.7±0.5ug。與原始M1 EVs相似，M1CCD的形態(tài)為典型的杯狀（圖2c），且裝載藥物后其Zeta電位幾乎不變。M1CCD的水動(dòng)力學(xué)尺寸為165±31nm（n=6），與原始M1 EVs相比增加了約36nm。M1CCD可在鹽酸鹽緩沖液（PBS）或10%胎牛血清中保存一周，顯示出良好的穩(wěn)定性（圖2d，e）。

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