第89-101步
徠卡101
染色
從患者到病理學(xué)家，準(zhǔn)備樣本進(jìn)行診斷需要細(xì)心、經(jīng)驗(yàn)以及合理的流程。
徠卡特地為大家整理了取材、組織脫水、透明、浸蠟、包埋以及染色等（常規(guī)、特殊、IHC以及FISH）101步操作流程，幫助大家更有效、更簡單地獲得實(shí)驗(yàn)方案，避免錯(cuò)誤的發(fā)生。
步驟八十九
使用高質(zhì)量切片
??正確：使用薄的，切片平整的切片，需將其在玻片上充分干燥。免疫組化和原味雜交宜使用帶電荷粘附載玻片。
?? 錯(cuò)誤：不平整，貼合不平整的切片的染色不均勻，背景會(huì)被不同程度染色。
這張低質(zhì)量染色的切片（HPV）有凸起及背景染色。
步驟九十
確保最佳固定方式
?? 正確：必須使用熟悉和恒定的固定條件（固定類型，pH，溫度，時(shí)間）獲得優(yōu)質(zhì)固定，以達(dá)到最佳結(jié)果。
?? 錯(cuò)誤：不穩(wěn)定的固定條件會(huì)導(dǎo)致樣本固定不足或固定過度，會(huì)使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定并且無法排查問題原因。
A.在充分固定的扁桃體切片上進(jìn)行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交反應(yīng)強(qiáng)烈，顏色銳麗。
B.在沒有充分固定的扁桃體切片上進(jìn)行 Kappa輕鏈mRNA原位雜交，反應(yīng)十分微弱。
步驟九十一
避免組織粘附
?? 正確：避免在撈片設(shè)備中使用蛋白質(zhì)成分粘附劑（膠水，淀粉，明膠），特別是在使用帶電荷的載玻片的時(shí)候。
?? 錯(cuò)誤：蛋白質(zhì)成分粘附劑會(huì)覆蓋在帶電荷載玻片的表面，造成組織粘附不均勻，使得原位雜交試劑從凸起切片的下方流出，導(dǎo)致染色不均一。
切片粘附不完全和折疊導(dǎo)致染色不均一（HPV）。
步驟九十二
優(yōu)化脫蠟和試劑應(yīng)用
??正確：在脫蠟和水化時(shí)，一定要保證試劑高效均一的分布在樣本表面。這樣才能保證染色均一，結(jié)果恒定。
?? 錯(cuò)誤：脫蠟不完全會(huì)導(dǎo)致無法染色或染色不佳。前處理和染色過程中在樣本表面形成的氣泡也會(huì)產(chǎn)生問題。
95°烤片形成氣泡導(dǎo)致染色不均一（HPV）。
步驟九十三
認(rèn)真挑選探針
?? 正確：根據(jù)探針特異性和敏感性進(jìn)行選擇。
?? 錯(cuò)誤：“我們只根據(jù)價(jià)格購買探針。”
兩張扁桃體切片都使用原位雜交對kapa輕鏈mMA進(jìn)行染色(BcIP/NBT)。兩張切片使用寡核苷酸探針來源不同。切片A顯色強(qiáng)烈而切片B顯色不足并只有部分細(xì)胞被染色。
步驟九十四
閱讀參數(shù)表
?? 正確：了解你的探針。一定要檢查參數(shù)表，來確認(rèn)當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)方法是否適用于特定的探針。仔細(xì)控制溫度和時(shí)間，提供最優(yōu)化的雜交條件。即該條件下，探針和目標(biāo)的特異結(jié)合最大化。
?? 錯(cuò)誤：不了解探針數(shù)據(jù)表：“我們用標(biāo)準(zhǔn)流程就行”。
兩張濕疣切片都使用原位雜交對HPV進(jìn)行染色。兩張切片使用同樣的DNA探針，但是雜交條件不同。切片A顯色強(qiáng)烈而切片B顯色失敗。
步驟九十五
優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件
?? 正確：選擇合適的預(yù)處理和優(yōu)化條件。取決于固定條件和組織類型。
?? 錯(cuò)誤：對不同的探針使用同樣的酶預(yù)處理?xiàng)l，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)果不佳。
這張切片使用 Poly d（T）陽性對照探針進(jìn)行染色。染色結(jié)果表明這張切片被蛋白酶K過度消化。不但造成粘液上皮細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)缺失，而且背景染色過重。
步驟九十六
仔細(xì)處理組織
??正確：仔細(xì)處理組織樣本并及時(shí)固定可以限制由內(nèi)源性RNA酶導(dǎo)致的RNA損失。
?? 錯(cuò)誤：處理組織時(shí)粗心大意，固定不及時(shí)，將會(huì)促進(jìn)由內(nèi)源性RNA酶導(dǎo)致更多的RNA損失。
扁桃體組織用 Poly d（T）陽性對照探針進(jìn)行染色，由于RNA酶降解RNA導(dǎo)致的染色不足。
步驟九十七
使用合適的顯色系統(tǒng)
??正確：選擇靈敏的顯色系統(tǒng)，優(yōu)化孵育條件。
?? 錯(cuò)誤：即使探針已與目標(biāo)結(jié)合，顯色系統(tǒng)靈敏度不夠也可能導(dǎo)致染色不足，甚至陰性結(jié)果。
該扁桃體切片染色不足是由于顯色系統(tǒng)靈敏度不夠造成的。Lambda輕鏈的原位雜交使用了非聚合物的顯色系統(tǒng)。
步驟九十八
避免試劑蒸發(fā)
??正確：在孵育過程中應(yīng)避免探針和其他試劑的蒸發(fā)。由于需要長時(shí)間孵育，試劑干結(jié)是一個(gè)常見問題。必須使用高質(zhì)量儀器。
?? 錯(cuò)誤：如果探針和其他試劑干結(jié)（通常在邊緣處），干結(jié)處將形成過重和非特異染色。
該扁桃體切片用原位雜交對 kappa輕鏈進(jìn)行顯色。切片在甲酰胺雜交過程中變得過干，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
步驟九十九
清洗步驟標(biāo)準(zhǔn)化
??正確：將整個(gè)流程的清洗步驟標(biāo)準(zhǔn)化（包括：持續(xù)時(shí)間，清洗液體積，攪動(dòng)方式），如此可保證穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果。
?? 錯(cuò)誤：同一探針在不同批次和日期的結(jié)果差異很大，這可能是由于操作者在清洗步驟上不夠標(biāo)準(zhǔn)造成的。
這2張扁桃體切片用原位雜交對 kappa輕鏈進(jìn)行顯色。切片A顯示過重的背景染色，而切片B背景清晰，這有可能就是由于切片A的清洗不足而造成的。
步驟一百
使用合適對照
??正確：每一批次都使用合適的對照。對照應(yīng)包含陽性對照和陰性對照，陽性對照為已知陽性的組織，陰性對照是使用非特異探針的檢測組織。
?? 錯(cuò)誤：“我們只在試驗(yàn)出現(xiàn)問題時(shí)才會(huì)使用質(zhì)控片。如果每一輪實(shí)驗(yàn)都做質(zhì)控片的話,大家沒有耐心去看的。”
這張切片使用 Poly d(T)陽性對照探針進(jìn)行染色。精確的染色表明該組織固定良好，RNA序列保存完整。
步驟一百零一
認(rèn)真評估結(jié)果
??正確：評價(jià)染色后的切片和對照時(shí)，知道觀察什么、觀察哪里。任何一個(gè)承擔(dān)原位雜交的工作人員都應(yīng)該對該技術(shù)的原理有基本的了解，應(yīng)知道哪里能找到陽性染色。
?? 錯(cuò)誤：無論在切片何處發(fā)現(xiàn)染色，都表明該次染色是成功的。
除了添加探針外，該扁桃體陰性對照切片完成了所有的原位雜交步驟。它表現(xiàn)出了鐵血黃素，該物質(zhì)天然即為棕色并可與DAB結(jié)合加深顯色，這并非陽性染色。
本期是我們徠卡101樣本診斷流程小貼士的最后一次分享，感謝大家一直以來的關(guān)注，我們希望通過這段時(shí)間的閱讀，傳遞學(xué)術(shù)知識(shí)，并能夠解決困擾大家的問題。未來我們還將帶給大家更多的精彩！
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