那么，能夠高效、安全遞送基因的rAAV是如何被生產(chǎn)出來(lái)呢？當(dāng)下主流的生產(chǎn)系統(tǒng)有兩種，一是利用經(jīng)典的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞產(chǎn)生病毒；另一種即利用攜帶rAAV載體基因組、Rep蛋白和Cap蛋白的桿狀病毒感染Spodoptera frugiperda（Sf9）昆蟲(chóng)細(xì)胞，從而產(chǎn)生rAAV病毒。這兩種生產(chǎn)系統(tǒng)有何差異？實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用時(shí)，哪種效果更好？
基于293細(xì)胞的rAAV包裝系統(tǒng)
圖1 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞生產(chǎn)rAAV
圖片來(lái)源：Mueller C et al., Curr Protoc Microbiol. 2012
Sf9包裝系統(tǒng)
Baculovirus/Sf9是一種替代哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的rAAV生產(chǎn)方案，該系統(tǒng)利用桿狀病毒表達(dá)載體（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV病毒顆粒。借助Sf9細(xì)胞可以大量表達(dá)重組蛋白的特點(diǎn)，該系統(tǒng)使用含有rAAV基因組以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Sf9細(xì)胞，使rAAV在Sf9細(xì)胞中組裝，最終達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)rAAV的目的。
由于Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞可以在大規(guī)模反應(yīng)器中高密度懸浮培養(yǎng)，因此該系統(tǒng)更容易放大規(guī)模；同時(shí)，桿狀病毒對(duì)于哺乳動(dòng)物和植物是非致病性的，且采用無(wú)血清培養(yǎng)體系，相較依賴質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)更為安全。2012年，歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)的首個(gè)rAAV基因治療藥物Glybera正是利用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV病毒顆粒。
293細(xì)胞包裝系統(tǒng)與Sf9包裝系統(tǒng)的差異
盡管在過(guò)去的10年里，監(jiān)管部門(mén)陸續(xù)批準(zhǔn)若干基于AAV的基因治療產(chǎn)品，但該領(lǐng)域仍面臨多項(xiàng)挑戰(zhàn)，例如rAAV的產(chǎn)量、質(zhì)量、免疫原性等。2020年9月，Neil G. Rumachik等人在Mol Ther Methods Clin Dev.發(fā)表的工作就對(duì)293細(xì)胞與Sf9細(xì)胞的rAAV生產(chǎn)系統(tǒng)差異做了分析。該工作發(fā)現(xiàn)，差異主要集中在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)、衣殼蛋白翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)和體內(nèi)/體外的感染效率（圖2）
圖2 Sf9細(xì)胞包裝系統(tǒng)與293細(xì)胞包裝系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV差異
圖片來(lái)源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
文中明確指出：
1）不同的包裝系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV病毒顆粒衣殼具有不同的PTMs，包括糖基化、乙酰化、磷酸化和甲基化（圖3）；
2）兩個(gè)包裝系統(tǒng)包裝過(guò)程中，rAAV基因組均發(fā)生甲基化，但兩套系統(tǒng)似乎對(duì)基因組產(chǎn)生了相反的作用，Sf9細(xì)胞生產(chǎn)體系產(chǎn)出的rAAV趨向抑制基因表達(dá)，293細(xì)胞生產(chǎn)的rAAV出現(xiàn)趨向激活基因表達(dá)；
圖3 293細(xì)胞和sf9細(xì)胞平臺(tái)生產(chǎn)的rAAV衣殼修飾差異
圖片來(lái)源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
3）不同系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV的空殼率及雜質(zhì)也有所差異，293細(xì)胞生產(chǎn)的rAAV病毒空殼率顯著更低（圖3），產(chǎn)生的雜質(zhì)與包裝過(guò)程產(chǎn)生的核酸和蛋白質(zhì)相關(guān)；而Sf9細(xì)胞系統(tǒng)空殼率相對(duì)較高，雜質(zhì)與內(nèi)肽酶活性和蛋白質(zhì)水解有關(guān)，此外，桿狀病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的雜質(zhì)要么是結(jié)構(gòu)性的，要么是與病毒逃逸有關(guān)。
4）另外，293細(xì)胞生產(chǎn)的rAAV顯現(xiàn)出更強(qiáng)的體內(nèi)及體外感染能力，研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，無(wú)論是通過(guò)肌肉注射還是通過(guò)尾靜脈系統(tǒng)給藥注射，293細(xì)胞生產(chǎn)的rAAV都具有更好的感染能力（圖4）。
圖4 不同生產(chǎn)體系生產(chǎn)的rAAV在體外及骨骼肌中的感染能力差異
圖片來(lái)源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020
因此，從這些數(shù)據(jù)展示可以看到，基于293細(xì)胞生產(chǎn)的rAAV可能比Sf9有更好的感染效率、更高的質(zhì)量，也更有臨床應(yīng)用的潛力。當(dāng)然，不可否認(rèn)的是，Sf9系統(tǒng)rAAV包裝體系具有更高的rAAV包裝產(chǎn)率，假以時(shí)日，解決上述問(wèn)題的Sf9包裝系統(tǒng)亦有潛力成為基因治療載體生產(chǎn)的重要力量。
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參考文獻(xiàn)