自1990年螢光素酶生物傳感器技術(shù)誕生以來，單螢光素酶檢測系統(tǒng)到雙螢光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炇侄巍?/span>
雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在單報告基因的基礎(chǔ)上引入了“內(nèi)參對照”報告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結(jié)果更為可靠。
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檢測原理
螢火蟲螢光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發(fā)出黃綠色光，其最強(qiáng)發(fā)光波長為560nm。
海腎螢光素酶也是一種胞內(nèi)蛋白，大小為36KDa。只需要氧氣就可以催化腔腸素，氧化生成高能產(chǎn)物coelenteramide，并發(fā)出藍(lán)光，其最強(qiáng)發(fā)光波長為465nm。
對于發(fā)光反應(yīng)，全透明板會有明顯的相鄰孔之間的信號干擾，使測量結(jié)果產(chǎn)生誤差。
為此常規(guī)實驗操作流程中先在普通的透明細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，加入檢測試劑待細(xì)胞裂解后把樣品轉(zhuǎn)移到全白檢測板中進(jìn)行檢測。但此操作復(fù)雜且容易使樣本損失。
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如何隔絕信號的同時
減少樣本損失？
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那么在雙熒光素酶檢測中應(yīng)該如何使用96孔白色培養(yǎng)板呢？
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
1、細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按70%的匯合度接種到96孔板。
2、轉(zhuǎn)染：16小時后轉(zhuǎn)染螢光素酶報告基因質(zhì)粒和RNA，每個樣品設(shè)置6個復(fù)孔。
1) 配制DNA和轉(zhuǎn)染試劑: 96孔板轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時每孔比例Firefly：Renilla：轉(zhuǎn)染試劑=0.1μg：0.01μg：0.25μL；
2) 配制RNA和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液，RNA的終濃度為100nM，轉(zhuǎn)染試劑每孔0.25μL；
3) 稀釋好的DNA和RNA及轉(zhuǎn)染試劑，常溫孵育5min；
4) 將稀釋好的DNA和RNA分別和轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min；
5) 每孔棄去50μL 培養(yǎng)基，將25μL DNA轉(zhuǎn)染混合液和25μL RNA轉(zhuǎn) 染混合液分別添加到每孔細(xì)胞樣品中；
6) 轉(zhuǎn)染6小時后，換新鮮完全培養(yǎng)基。
雙報告基因檢測
1、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48小時后，棄去培養(yǎng)基，用100μL1XPBS洗1遍；
2、 傾斜96孔板，吸干剩余的PBS；
3、去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫；
4、每孔加50μl稀釋好的1XPLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解；
5、加入預(yù)先混好的LAR II，2s后測數(shù)據(jù)；
6、每孔添加100μL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)。
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