一、引言：抗體偶聯(lián)藥物——腫瘤治療的“生物導(dǎo)彈”
抗體偶聯(lián)藥物（Antibody–drug conjugates，ADCs）被譽(yù)為腫瘤治療的“生物導(dǎo)彈”，通過抗體靶向腫瘤細(xì)胞，精準(zhǔn)釋放細(xì)胞毒性載荷，極大提升了療效并降低系統(tǒng)毒性。
自2000年首款A(yù)DC藥物Mylotarg上市以來，全球已有超17款A(yù)DC獲批（截止到2024年），覆蓋血液瘤和實(shí)體瘤，市場(chǎng)估值超百億美元。而ADC的復(fù)雜結(jié)構(gòu)（由抗體、連接子及有效載荷組成，如Fig.1所示）對(duì)生產(chǎn)工藝提出了極高要求。本文將聚焦陽離子交換層析在ADC高效純化中應(yīng)用。
Fig.1 Anti-CD30 MMAE conjugate (brentuximab vedotin; Adcetris®)結(jié)構(gòu)
二、 抗體偶聯(lián)藥物質(zhì)量屬性簡(jiǎn)述
生物制品工藝開發(fā)的核心目標(biāo)在于構(gòu)建穩(wěn)健可控的生產(chǎn)工藝體系，確保可重復(fù)制備出符合預(yù)設(shè)質(zhì)量屬性的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。對(duì)于傳統(tǒng)非抗體偶聯(lián)藥物（Non-ADC biologics），其關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute, CQA）包括可能影響臨床安全性與有效性的關(guān)鍵指標(biāo)，如產(chǎn)品大小相關(guān)變異體（如聚集體、片段）、電荷異質(zhì)性、氧化變體等，工藝相關(guān)雜質(zhì)（宿主細(xì)胞蛋白、DNA殘留）、濃度、活性等。而抗體藥物偶聯(lián)物由于兼具生物大分子與化學(xué)小分子的雙重特性，還需額外關(guān)注其他質(zhì)量屬性，包括藥物抗體比率（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、DAR值的組成、游離毒素殘留、偶聯(lián)反應(yīng)溶劑殘留等。
游離毒素作為高風(fēng)險(xiǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)。這類未偶聯(lián)小分子因缺乏靶向遞送機(jī)制，無法特異性作用于治療靶點(diǎn)，未能提升療效，可能會(huì)引發(fā)全身毒性風(fēng)險(xiǎn)。此外，工藝開發(fā)需同步關(guān)注偶聯(lián)反應(yīng)體系中引入的有機(jī)溶劑（如DMF、DMSO）、還原劑（如TCEP）等工藝相關(guān)雜質(zhì)的清除效率，確保終產(chǎn)品符合質(zhì)量屬性放行要求。
三、陽離子交換層析在ADC純化中的應(yīng)用
1、陽離子層析去除游離毒素
結(jié)合-洗脫色譜法作為一種常規(guī)分離技術(shù)，可有效實(shí)現(xiàn)ADC中游離毒素的去除。該方法基于ADC與游離毒分子間顯著的理化特性差異，通過選擇性吸附實(shí)現(xiàn)高效分離。
在層析工藝中，首先對(duì)含有游離毒素及溶劑的偶聯(lián)反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)節(jié)到目標(biāo)上樣條件，隨后上樣至色譜柱，借助離子相互作用選擇性捕獲ADC，游離藥物及殘余溶劑因缺乏有效結(jié)合位點(diǎn)而隨流動(dòng)相直接穿透。
但是部分色譜填料可能與非目標(biāo)組分（如游離毒素）以及游離毒素可能與ADC存在非特異性相互作用。因此，建議進(jìn)行系統(tǒng)化的填料篩選，必要時(shí)可引入強(qiáng)化淋洗步驟，以確保游離毒素的完全清除。
Fig.2展示了陽離子交換色譜通過結(jié)合-洗脫模式去除游離藥物的典型流程。通過上樣過程以及平衡緩沖液的持續(xù)淋洗可有效去除殘留的游離毒素（游離毒素含量由52.2%降低至5.0%），從而實(shí)現(xiàn)游離毒素與ADC高效分離。
Fig.2 陽離子交換層析純化圖譜
Table 1. 陽離子交換層析純化方法
2、陽離子層析去除聚集體
ADC產(chǎn)品工藝的復(fù)雜性，決定了其在偶連工藝結(jié)束后可能會(huì)導(dǎo)致聚集體含量升高至不可接受的水平，因此在偶聯(lián)后引入純化步驟可能是必要的，以確保該工藝能夠滿足所需產(chǎn)品質(zhì)量要求。
對(duì)此可采用陽離子結(jié)合-洗脫色譜法，可有效實(shí)現(xiàn)ADC中聚集體的去除。如下所示，該方法基于聚集體與單體的理化特性差異實(shí)現(xiàn)高效分離，該ADC采用還原鏈間二硫鍵后偶聯(lián)，純化方法如下：
• A液90mM NaAC-HAC，pH5；
• B液400mM NaAC-HAC，pH5；
• 載量60mg/mL；
• 洗脫0→100% B液，20CV線性梯度洗脫，分段收集，結(jié)果如下所示，可知陽離子層析可以有效去除ADC中殘留的聚集體。
Fig.3 陽離子交換層析聚集體去除結(jié)果
四、博格隆陽離子層析介質(zhì)
博格隆公司創(chuàng)新研發(fā)的Diamond CD-S陽離子填料不僅適用于單克隆抗體、雙特異性抗體、融合蛋白等的精細(xì)純化，也可滿足ADC生產(chǎn)工藝中游離毒素以及聚集體去除的要求，其具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1、高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，其在高鹽濃度下仍具有較高的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（10%DBC可達(dá)100 g/L，如下圖所示）；
Fig.4 陽離子交換層析Diamond CD-S 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量圖
2、采用高剛性瓊脂糖微球，具有高流速、低反壓特點(diǎn)，更適用于產(chǎn)業(yè)化，耐壓5bar；
3、優(yōu)異分辨率、穩(wěn)定的批間一致性；
4、良好的有機(jī)溶劑耐受性（15% DMSO加速40℃加速7天穩(wěn)定性良好），可用于ADC產(chǎn)品純化。
此外，博格隆提供的Diamond SP Mustang等系列陽離子交換層析產(chǎn)品，可完整覆蓋從裸抗精細(xì)純化到ADC純化的工藝需求。
參考文獻(xiàn)：
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關(guān)于博格隆
博格隆成立于2008年，是一家專注于為分離純化提供高質(zhì)量層析介質(zhì)的高新技術(shù)企業(yè)，是中國(guó)較早具備大規(guī)模生產(chǎn)分離純化介質(zhì)能力的企業(yè)之一。博格隆所提供的產(chǎn)品涵蓋各類分離純化介質(zhì)、預(yù)裝柱、實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)級(jí)空柱、微載體，同時(shí)提供分離純化工藝開發(fā)服務(wù)及填料定制。