腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）是表達(dá)基因序列的理想載體，由于其種類多樣、免疫原性低、擴(kuò)散能力強(qiáng)、宿主范圍廣等優(yōu)勢(shì)在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據(jù)主導(dǎo)地位。目前FDA已批準(zhǔn)了兩款基于AAV的基因治療藥物，近年來，隨著對(duì)AAV衣殼開發(fā)和基因組優(yōu)化的研究深入，更加推動(dòng)了AAV在基因研究和基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。
腺相關(guān)病毒載體
腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一，是一類無法自主復(fù)制、無被膜、具有二十面體結(jié)構(gòu)的微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。
重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant AAV, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的基因載體，研究中采用的rAAV通常為AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體。
rAAV載體空殼率
隨著rAAV載體的基礎(chǔ)研究、臨床前研究和臨床研究的不斷深入，在rAAV載體制備過程中，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性、純度是產(chǎn)品質(zhì)控的重要內(nèi)容。
rAAV衣殼是由60個(gè)衣殼蛋白亞單位構(gòu)成，排列成二十面體結(jié)構(gòu)，包含載體DNA基因組。在rAAV載體制備過程中，除了含有全長(zhǎng)DNA基因組的完整rAAV載體外，有一定比例的rAAV顆粒不含任何DNA基因組，被稱為空病毒顆粒。在Rep蛋白的參與下，組裝好的空病毒顆粒向核質(zhì)遷移，而DNA的包裝則發(fā)生在已組裝完畢的空病毒顆粒遷移至核質(zhì)后，這促進(jìn)了形成空病毒顆粒的概率。
此外，還存在一定比例的含有部分DNA的病毒顆粒，DNA過度裝載的病毒顆粒，以及rAAV多聚體（圖1）。
圖1 rAAV制備過程中產(chǎn)生的病毒顆粒主要類型（圖片來源：參考文獻(xiàn)1）
rAAV載體空殼率高所帶來的影響
現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，大量空病毒顆粒的存在可能會(huì)影響rAAV載體的有效性和安全性，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)增加rAAV載體的免疫原性，增加免疫毒性的風(fēng)險(xiǎn)，或通過競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面受體結(jié)合位點(diǎn)、內(nèi)吞作用及胞內(nèi)過程，影響rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，在rAAV載體制備和純化過程中，優(yōu)化生產(chǎn)工藝、建立有效的純化方法，以降低rAAV空病毒顆粒數(shù)，盡可能純化獲得含有全長(zhǎng)DNA基因組的完整rAAV載體，確保rAAV載體安全、穩(wěn)定、有效，是產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的重要一環(huán)。
如何獲得空殼率更低、更可控的載體？
目前對(duì)于去除rAAV載體中的空病毒顆粒主要是在病毒純化過程中實(shí)現(xiàn)的，策略依賴于rAAV載體和空病毒顆粒的物理性質(zhì)差異。
密度梯度離心法（Density gradient ultracentrifugation, DGC）：空病毒顆粒（不含DNA基因組）和含有部分DNA的病毒顆粒在較低的密度區(qū)間聚集，因此借助碘克沙醇或氯化銫（CsCl）經(jīng)過多次密度梯度離心后，可以很容易將空病毒顆粒與rAAV載體分離，DGC法目前適用于所有血清型的純化。
離子交換層析法（ion-exchange chromatography, IEC）：rAAV載體的等電點(diǎn)會(huì)比空病毒顆粒略低，因此借助IEC法可以將空病毒顆粒去除。IEC法目前在某些血清型載體（如rAAV1、2、6）中去除空殼效果不錯(cuò)，然而對(duì)于不同血清型的rAAV載體可能需要建立不同的純化方法。
低空殼率rAAV大起底
空殼的腺相關(guān)病毒會(huì)為科學(xué)研究和基因治療藥物開發(fā)帶來不可控因素和風(fēng)險(xiǎn)，因此人們?cè)诓粩嗵剿骺刂瓶諝AAV載體產(chǎn)生的辦法。空殼rAAV的形成與病毒生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)粒配比、細(xì)胞培養(yǎng)水平、rAAV出毒時(shí)間均有一定關(guān)系，而下游腺相關(guān)病毒純化過程更是減少空殼rAAV的重要核心環(huán)節(jié)。
基于12年、30000+的病毒載體生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，和元生物持續(xù)優(yōu)化病毒生產(chǎn)全流程，用更優(yōu)化的質(zhì)粒配比、病毒收獲時(shí)間，借助超離、超濾、層析、PEG沉淀等科研及工業(yè)生產(chǎn)中的整合純化工藝，持續(xù)降低rAAV載體包裝中的空殼率，可做到<5%空殼率（實(shí)際工作中通常<2%），為研究者提供更好的基因載體。
2021年，我們選擇同一載體、不同生產(chǎn)廠商的腺相關(guān)病毒，發(fā)起了空殼率雙盲測(cè)試，電鏡結(jié)果顯示，和元生物的腺相關(guān)病毒空殼率遠(yuǎn)低于行業(yè)一線品牌。
樹立行業(yè)標(biāo)桿，讓基因遞送觸手可及！
圖2 rAAV載體生產(chǎn)空殼率大比拼
為了更好地顯示和元生物AAV產(chǎn)品的屬性，我們選取大視野進(jìn)行比較
圖3 和元生物rAAV載體生產(chǎn)空殼率
電鏡結(jié)果：包裝DNA基因組的病毒顆粒為實(shí)心顆粒（紅色箭頭）；空病毒顆粒中間存在空洞（黃色箭頭）
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參考文獻(xiàn)
[1] Maria Schn?dt, et al., Improving the Quality of Adeno-Associated Viral Vector Preparations: The Challenge of Product-Related Impurities. Hum Gene Ther Methods. 2017 Jun;28(3):101-108. doi: 10.1089/hgtb.2016.188.
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