??? 有了熒光，生物世界開始變得很美妙。由于只需物理方法（光照）即可檢測(cè)，無(wú)需涉及化學(xué)反應(yīng)，亦無(wú)同位素的危險(xiǎn)，熒光技術(shù)早已成為研究生物微觀世界中最方便、最重要的示蹤工具之一。生物通11月聚焦絢麗多彩的熒光染料，為大家介紹常用的核酸染料、蛋白染料、細(xì)胞器染料以及熒光蛋白。在此之前，我們有必要先了解一些熒光的基本知識(shí)。
熒光激發(fā)三部曲
??? 能夠發(fā)出熒光并能作為染料的化合物稱為熒光基團(tuán)或熒光染料。有的熒光基團(tuán)本身不發(fā)光，可卻能特異高效地結(jié)合某類生物大分子，并在結(jié)合后發(fā)出美麗的熒光，比如核酸染料；有的熒光基團(tuán)本身可以在一定條件下發(fā)出熒光，我們需要將這個(gè)“明燈”以特殊的方法“掛”在某些可“指路”的生物大分子上，使這大分子變成“指路燈”，可用于定位生物標(biāo)本中的特定區(qū)域或者示蹤，這時(shí)我們通常稱之為熒光探針。
???? 除了熒光染料，還有一類蛋白質(zhì)能被激發(fā)出各種顏色的美麗熒光，常用于蛋白表達(dá)標(biāo)簽而作為示蹤或者定量的工具，如大名鼎鼎的綠色熒光蛋白就是其中之一，這個(gè)生物通將在后續(xù)的文章中另作介紹。
美麗的熒光從哪里來(lái)？
第1階段：激發(fā)
?? 激發(fā)光源如白熾燈或激光提供了光子能量hνEX。熒光基團(tuán)吸收能量后，到達(dá)單重激發(fā)態(tài)(S1')。此過(guò)程就將熒光和化學(xué)發(fā)光區(qū)別開來(lái)，因?yàn)楹笳叩募ぐl(fā)態(tài)是由化學(xué)反應(yīng)引起的。
第2階段：激發(fā)態(tài)的壽命
?? 激發(fā)態(tài)的壽命很短暫，通常只有1到10納秒。在這段時(shí)間內(nèi)，熒光基團(tuán)經(jīng)歷了構(gòu)象的改變，并與它所處的分子環(huán)境發(fā)生了大量的相互作用。此過(guò)程有兩個(gè)重要的結(jié)果：第一，S1'的能量部分損失，使熒光基團(tuán)到達(dá)能量略低的S1單重激發(fā)態(tài)。第二，并不是所有被激發(fā)的分子最終都通過(guò)熒光發(fā)射回到基態(tài)（S0）。碰撞淬滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等過(guò)程也會(huì)使S1減少。
第3階段：熒光發(fā)射
?? 在這一階段，熒光基團(tuán)釋放出光子能量hνEM，回到基態(tài)S0。由于能量損耗，光子的能量減少，發(fā)射波長(zhǎng)總是大于其激發(fā)波長(zhǎng)，兩者之間的差值叫斯托克斯位移（Stokes shift）。在熒光分析中，就是利用斯托克斯位移現(xiàn)象，將激發(fā)光與熒光物質(zhì)的發(fā)射光分離開來(lái)，只檢測(cè)發(fā)射光，從而提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。有些熒光色素的斯托克斯位移較大，而有些熒光色素的斯托克斯位移較小。斯托克斯位移越大，其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊就越少，有利于提高其分辨率。
熒光光譜
?? 在我們選擇熒光染料時(shí)，熒光光譜是不可不看的，激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)等重要信息都蘊(yùn)含其中。激發(fā)光譜是通過(guò)測(cè)量熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化而獲得的光譜；而發(fā)射光譜是在固定激發(fā)波長(zhǎng)下掃描發(fā)射單色器所測(cè)得的光譜。在熒光分析中，可利用激發(fā)光譜選擇靈敏的激發(fā)光波長(zhǎng)，利用發(fā)射光譜選擇靈敏的檢測(cè)波長(zhǎng)。
? ?在激發(fā)光譜上可以看到在某一激發(fā)波長(zhǎng)下，該熒光染料具有最大的發(fā)射熒光強(qiáng)度，則該激發(fā)光波長(zhǎng)稱為最大激發(fā)波長(zhǎng)λex。在發(fā)射光譜上，最大發(fā)射熒光強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大發(fā)射波長(zhǎng)λem。通常會(huì)將一種染料的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜放在同一張圖上，如圖2所示。這是Hoechst 33342與DNA結(jié)合后的光譜圖，它的最大激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm，中間的差值即為斯托克斯位移。測(cè)定熒光時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)在λex、發(fā)射波長(zhǎng)在λem的檢測(cè)靈敏度最高。
熒光儀器
?? 要想看到絢麗的熒光，除了熒光染料，檢測(cè)系統(tǒng)也是必不可少的。熒光檢測(cè)儀器有幾個(gè)基本要素：1) 激發(fā)光源，2) 將發(fā)射光子與激發(fā)光子分開的濾光片，3) 記錄所產(chǎn)生的電信號(hào)或圖像的探測(cè)器。
我們經(jīng)常使用的儀器主要有4種類型，每一種都提供了完全不同的信息：
? 熒光分光光度計(jì)和微孔板讀數(shù)儀主要測(cè)量大量樣品（微升到毫升）的平均性質(zhì)。
? 熒光顯微鏡在二維或三維的空間座標(biāo)中解析微小物體（直徑小于0.1 mm）的熒光。
? 熒光掃描儀，包括芯片掃描儀，在二維的空間座標(biāo)中解析大物體（如電泳膠、印跡和層析圖）的熒光。
? 流式細(xì)胞儀測(cè)量流動(dòng)束中每個(gè)細(xì)胞的熒光，鑒定并定量大樣品中的亞群。
?? 其他類型的儀器也能進(jìn)行熒光檢測(cè)，如毛細(xì)管電泳裝置、DNA測(cè)序儀和微流體設(shè)備。每種儀器對(duì)熒光探針的要求都不盡相同。比如，對(duì)熒光顯微鏡而言，光漂白是一個(gè)大問(wèn)題，但是對(duì)于流式細(xì)胞儀來(lái)說(shuō)，這不算什么，因?yàn)楣庠凑丈浼?xì)胞的時(shí)間很短暫。
如何選擇熒光染料
?? 現(xiàn)在市場(chǎng)上的熒光染料也是越來(lái)越多，相同用途的染料也分好多類，真是眼花繚亂，不知該如何下手。其實(shí)也不必這么糾結(jié)，搞清楚以下幾點(diǎn)就行了。首先，你的用途是什么；其次，了解儀器的特性-激發(fā)波長(zhǎng)和濾光片，然后再結(jié)合光譜圖來(lái)選擇合適的染料。如果還是有多個(gè)選擇，那么可以比較一下它們的量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等等。一般說(shuō)來(lái)，熒光基團(tuán)的量子產(chǎn)率要在0.35以上，才能用于熒光分析。另外還要注意染料的通透性，特別是細(xì)胞器染料，會(huì)分為活細(xì)胞和死細(xì)胞兩種，一定要看清楚了。
?? 百螢生物科技小貼士：初次使用的人士還是多看看文獻(xiàn)吧，一來(lái)可以導(dǎo)購(gòu)，二來(lái)可作為實(shí)驗(yàn)的參考。熒光染料這種化學(xué)物質(zhì)，它的說(shuō)明書一般都不會(huì)很詳細(xì)，只是泛泛地列出了使用的濃度范圍，你千萬(wàn)別指望有質(zhì)粒抽提試劑盒那樣的protocol。小編曾經(jīng)就這個(gè)問(wèn)題問(wèn)過(guò)相關(guān)的技術(shù)人員，他的回答是，這東西就像醬油，只能告訴你做菜加一點(diǎn)，具體是加5滴還是一勺，那只能是自己摸索。
多色標(biāo)記
?? 當(dāng)多重分析成為一種潮流，更多的實(shí)驗(yàn)也開始引入兩種或以上的探針，來(lái)同時(shí)監(jiān)測(cè)不同的生化功能。這種多色標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用于流式細(xì)胞儀、DNA測(cè)序、熒光原位雜交和細(xì)胞器標(biāo)記中。在選擇同時(shí)使用的幾種熒光探針時(shí)，必須注意熒光染料的發(fā)射光譜需要足夠分開，才能有利于信號(hào)分離和數(shù)據(jù)分析。一般選擇發(fā)射光譜沒(méi)有交叉或交叉小，發(fā)射峰值波長(zhǎng)不同，熒光發(fā)射強(qiáng)度相當(dāng)，在儀器上各熒光信號(hào)彼此能夠分開的熒光探針標(biāo)記樣品。因此，那些光譜帶寬窄的染料更受歡迎，比如AAT的Cal系列。當(dāng)然，最理想的組合是那些激發(fā)波長(zhǎng)一致，而發(fā)射波長(zhǎng)相去甚遠(yuǎn)的染料。但理想歸理想，這樣的組合往往不多見。
光漂白
?? 提高激發(fā)光的強(qiáng)度可以提高熒光的強(qiáng)度，但是，激發(fā)光的強(qiáng)度不是可以無(wú)限提高的。因?yàn)榧ぐl(fā)光的強(qiáng)度超過(guò)一定限度時(shí)，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子，這就是光漂白的現(xiàn)象。對(duì)于熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡而言，光源需長(zhǎng)時(shí)間照射樣品，光漂白現(xiàn)象就可能嚴(yán)重影響測(cè)量。
解決光漂白問(wèn)題的最有效辦法是增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度，這樣就能降低激發(fā)光的強(qiáng)度。使用CCD照相機(jī)等低亮度的檢測(cè)裝置，以及高數(shù)值孔徑物鏡和最寬帶通的濾光片，都能增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。當(dāng)然，最好是選擇一些光穩(wěn)定性更好的染料，例如fluo-8m染料就比fluo-8m要強(qiáng)得多。另外，你也可以使用抗淬滅劑。它們可以降低光漂白，不過(guò)不能用于活細(xì)胞。但需要注意的是，這些方法只是僅供參考，是否奏效還很難說(shuō)，因?yàn)樵谀撤N程度上，光漂白速率還取決于熒光基團(tuán)所處的環(huán)境。
?? 本文只是對(duì)熒光染料的最基本知識(shí)作了簡(jiǎn)單介紹，屬于掃盲班類別，如果你想更深入地了解它們，我們將會(huì)介紹常用的核酸染料、蛋白染料、細(xì)胞器染料和熒光蛋白，如需了接更多登陸www.tjbiolite.com。