通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 PBMC（外周血單核細(xì)胞）?分析可廣泛應(yīng)用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥免疫治療和基于細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)研究。PBMCs通常通過密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細(xì)胞與紅細(xì)胞 (RBC) 等其他細(xì)胞成分分離。
流式細(xì)胞術(shù)的一個常見應(yīng)用是 PBMC 免疫表型分析。該技術(shù)測量被稱為“分化簇”(CD) 標(biāo)記的細(xì)胞表面分子的表達(dá)，以識別、區(qū)分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標(biāo)記表達(dá)之外，計數(shù)和細(xì)胞大小的精確監(jiān)測對于該分析也至關(guān)重要。其中一個例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細(xì)胞癌癥免疫治療領(lǐng)域。
為了表征 PBMC 上的 CD 標(biāo)記，將針對 CD 標(biāo)記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團(tuán)綴合。然后使用流式細(xì)胞儀測量熒光強(qiáng)度，以量化 CD 標(biāo)記表達(dá)水平并區(qū)分 PBMC 亞群。本應(yīng)用說明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標(biāo)記的單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán) PBMC 染色技術(shù)。
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CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備
材料：
·?1.Buccutite? 快速 PE 抗體標(biāo)記試劑盒（貨號 1310）
注意：試劑盒足以進(jìn)行 2 次標(biāo)記反應(yīng)，每個反應(yīng) 100 μg 抗體
·?2.Buccutite? 快速 APC 抗體標(biāo)記試劑盒（貨號 1311）
注意：試劑盒足以進(jìn)行 2 次標(biāo)記反應(yīng)，每個反應(yīng) 100 μg 抗體
·?3.1X PBS 緩沖液 (pH 7.2 – 7.4)
·?4.4 個 2 mL 洗滌管
·?5.4 個 1.5 mL 收集管
·?6.離心機(jī)
所有 CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物均使用以下應(yīng)用說明制備：
·?Buccutite? 快速藻膽蛋白抗體偶聯(lián)
CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的濃度：
使用 Buccutite? 快速藻膽蛋白抗體偶聯(lián)應(yīng)用說明和 Buccutite? 快速抗體標(biāo)記試劑盒（貨號 1310 和 1311）制備的 CD45 和小鼠 IgG 偶聯(lián)物的最終濃度如下：
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PBMC的制備
冷凍保存的PBMC解凍并制備如下：
材料：
1.人類PBMC（冷凍保存，1000萬個細(xì)胞/瓶）
2.血細(xì)胞培養(yǎng)基
3.胎牛血清
4.15mL錐形管
5.?離心機(jī)
6.?吸管
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制備方法
1.?收到冷凍的 PBMC 后，立即解凍細(xì)胞并開始培養(yǎng)，以保持最高的細(xì)胞活力。
2.?要解凍細(xì)胞，請將小瓶放入 37°C 水中，輕輕攪拌約 1 分鐘。
a.?注意：將蓋子遠(yuǎn)離水以盡量減少污染風(fēng)險。
3.?將細(xì)胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 mL 新鮮血細(xì)胞培養(yǎng)基的 15 mL 錐形管中。
a.?注意：總體積 = 10.1 mL（100 μL PBMC + 9 mL 新鮮血細(xì)胞培養(yǎng)基 + 1 mL 胎牛血清）
4.?在室溫下以 1,000 rpm (~220g) 離心 5 分鐘。
5.?取出上清液，細(xì)胞即可使用。
PBMC 的單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán)染色：
前兩節(jié)中制備的綴合物和 PBMC 用于以下細(xì)胞表面免疫標(biāo)記方案。
材料：
·?1.PBMC
·?3.測定緩沖液（含 1% BSA 的 HHBS 緩沖液）
·?5.TruStain FcX?CD45 – PE 結(jié)合物
·?6.CD45 – APC 綴合物
·?7.CD4 – FITC 綴合物
·?8.CD3 – APC 綴合物
·?9.小鼠 IgG – PE 綴合物
·?10.小鼠 IgG – APC 綴合物
·?11.NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀
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PBMC 染色：
1.?在免疫標(biāo)記之前，使用臺盼藍(lán)染料排除測試（2452）確定 PBMC 活力，每個樣品使用 100 萬個細(xì)胞。
2.?用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過離心機(jī)以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。
3.?為了阻斷非特異性 Fc 介導(dǎo)的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX??5 μL/100 μL 檢測緩沖液中，并在室溫10分鐘。
4.?對于單熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 μg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。
5.?對于雙熒光團(tuán) PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 μg，在冰上避光保存 20 分鐘。
6.?用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。
7.?在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。
使用 Buccutite? 綴合技術(shù)生成的綴合物可提供高質(zhì)量的產(chǎn)量。這些綴合物在 PBMC 上進(jìn)行了測試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進(jìn)行多色染色，以檢測 PBMC 中的 CD 標(biāo)記。
使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用單熒光團(tuán)和雙熒光團(tuán)對 PBMC 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。密度圖（最左邊）用于從其他細(xì)胞群中排除淋巴細(xì)胞。直方圖（右上）和密度圖（右下）分別用于單次和多次熒光團(tuán)染色。數(shù)據(jù)記錄在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式細(xì)胞儀上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版進(jìn)行分析。