1、免疫檢測的基礎知識
ELISA是一種免疫測定。免疫測定（immunoassay，IA）是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。
1.1 抗原
抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質?？乖M入機體后，可刺激機體產生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質。小分子化合物在與大分子蛋白質結合后能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥物等。抗原的反應性取決于抗原決定簇（antigenic determinant），或稱為表位（epitope）。一個抗原分子可帶有不同的決定簇。
1.2 抗體
1.2.1 抗體的結構
抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。IgG的結構見圖。
IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段（Fab）。每個Fab都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合后不出現凝集或沉淀。另一區段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有
的抗原性。
IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結合；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。
IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結合價，由于空間位置的影響，只表現為五個抗原結合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。
機體被微生物感染后，先產生IgM抗體，然后產生IgG抗體。經過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續數年之久。
IgM抗體一般為保護性抗體，具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。
1.2.2 抗體的產生
機體受抗原刺激后，B淋巴細胞產生相應的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。每一系B細胞只產生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機體，則將由多系的B細胞產生相應的多種抗體，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬制得。產生抗體的B細胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細胞融合成雜交瘤細胞。將單個雜交瘤細胞分離，在體內或體外培養而分泌的抗體單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb或Mab）。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細胞（含產生抗體的B細胞）與小鼠腫瘤細胞融合，分離雜交瘤細胞，接種于小鼠腹腔，產生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。
1.3 抗原抗體反應
1.3.1 可逆性 抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab。.抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結合力，可以平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]。Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應用于免疫測定中可得到更好的效果。
1.3.2 最適比例 在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現象（zone phenomenon）?？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現假陰性。
1.3.3 特異性 抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。
但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結構的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH發生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發生交叉反應。因此在作為早孕診斷（敏感度應達到50mIu/mlhCG）的實際中必須應用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應的發生。
1.3.4 敏感性 在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。
1.4 免疫測定在臨床檢驗中的應用
由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：
1) 體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。
2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。
3) 抗生素和藥物。
4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。
5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs等。
1.5． 標記的免疫測定
如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物徹底反應。以標記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反應產物中有與Ag結合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，游離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。
1.6． 酶免疫測定
酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應后形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應用。非均相EIA需先進行游離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay），簡稱ELISA，在國內有譯作酶聯免疫吸附試驗或酶標，已習用。
2、ELISA的原理和類型
2.1. ELISA的原理
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。
2.2. ELISA的類型
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為“酶聯物”、“結合物”（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：
2.2.1 雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由于去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
2.2.3 間接法測抗體(我公司分裝TORCH及傳染病試劑盒大多采用本法)
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
4）加底物顯色
本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。
2.2.4 競爭法測抗體
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般采用此法。
2.2.5 競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
2.2.6 捕獲包被法測抗體（經典方法）
IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。
類風濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。
2.2.7 ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由于一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通
ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。
科研項目中檢測微量的成分如細胞因子常采用本法。
晶美分裝ELISA KIT采用的方法：
- TORCH及傳染病試劑盒（間接法），見2.2.3
- TORCH-IgM捕獲法
特色：包被抗體，標記抗原
原理：
產品特色：采用ABC法，靈敏度更高，特異性更強。
生物素抗體和酶聯物是濃縮的，使用前需用相應的緩沖液稀釋。酶聯物可以通用。
3、ELISA的試劑
在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。前文（2.2）已述，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（5）酶聯物（結合物）及標本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應終止液。
3.1 免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月以上。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。
3.1.1 固相載體
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。
ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯孔條或12聯孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果?，F在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。
良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數之差，應小于10%。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。
在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為00-200ul，而小試管可根據需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。
也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。
3.1.2 包被的方式
將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體結合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉涀贤饩€照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系
統作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。
脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養物等，須經提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。Ｖ亟M抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質粒體。重組抗原的優點是除工程菌成份外，其他雜質少，而且無傳染性，但純化技術難度較大。以大腸桿菌為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現假陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質（BSA）等偶聯，借助于偶聯物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發生反應。另外，某些微生物發生變異時往往發生抗原結構變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。
3.1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定?？贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（見2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。
3.2 酶聯物（結合物）
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩定性。
3.2.1酶
用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉化率高，專一性強