在抗體純化過程中，聚集體的去除一直是個(gè)讓人頭疼的問題，聚集體的存在會嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。
作為抗體純化工藝中最常用的捕獲步驟，Protein A親和層析在抗體捕獲方面具有高效性，能夠有效去除宿主細(xì)胞蛋白（HCP）和DNA等工藝相關(guān)雜質(zhì)。
然而，在去除抗體聚集體方面，Protein A親和層析卻存在一定局限。聚集體通常與單體結(jié)合更緊密，即便通過調(diào)整洗脫pH值，仍難以實(shí)現(xiàn)良好的分離。因此，去除聚集體往往依賴于后續(xù)的中度純化和精細(xì)純化步驟，而較高含量的聚集體可能會對后續(xù)純化工藝帶來較大挑戰(zhàn)。
今天我們來聊聊一篇文獻(xiàn)中介紹的新策略，助力您在Protein A純化過程中更有效地去除抗體聚集體。
聚乙二醇（PEG）+氯化鈣/氯化鈉組合
研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種創(chuàng)新方法，顯著提升了Protein A層析去除聚集體的效果。該方法在淋洗和洗脫緩沖液中加入聚乙二醇（PEG）和氯化鈣/氯化鈉組合，通過優(yōu)化添加濃度，實(shí)現(xiàn)了單體和聚集體的幾乎完全分離。
原理解析
PEG對Protein A洗脫峰形的影響
在本研究中，研究者嘗試通過在洗脫緩沖液中加入不同濃度的PEG（1.5%、3%、5%和10%），以觀察PEG對Protein A洗脫曲線的影響。
PEG作為一種廣泛應(yīng)用于層析的添加劑，通常可以提高單體和聚集體在羥基磷灰石、離子交換和多模式層析柱上的分辨率。這是因?yàn)镻EG能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)在這些層析柱上的保留，且這種效應(yīng)隨著蛋白分子大小的增加而增強(qiáng)。
然而，在Protein A層析柱上，添加高達(dá)10%的PEG并未能改善單體和聚集體的分辨率，反而僅僅使目標(biāo)抗體的保留時(shí)間略有增加，洗脫峰變得更尖銳。這一發(fā)現(xiàn)解釋了為什么此前文獻(xiàn)中沒有報(bào)道在Protein A層析中使用PEG去除聚集體的方法。
氯化鈣對Protein A洗脫峰形的影響
在另一項(xiàng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)，在Protein A洗脫緩沖液中加入500mM離液鹽（如氯化鈣和氯化鎂）可以顯著提高異源二聚體和同源二聚體在Protein A柱上的分辨率，并使這兩類抗體在較高pH條件下洗脫。研究者認(rèn)為，這些離液鹽通過改變抗體與Protein A配基之間的疏水作用，從而提高了填料的選擇性。
基于這一研究，本文進(jìn)一步探討了氯化鈣在去除聚集體中的潛在應(yīng)用。研究中比較了不同濃度氯化鈣（250mM、500mM、750mM和1M）對Protein A洗脫峰形的影響。結(jié)果顯示，氯化鈣的確能夠在一定程度上改善單體和聚集體的分辨率，且500mM氯化鈣效果最佳。
操作建議
研究表明，單純使用PEG作為添加劑并不能有效改善Protein A柱中抗體單體和聚集體的分離效果。而氯化鈣作為添加劑，能通過調(diào)整疏水作用提高分辨率，尤其在去除抗體聚集體方面具有較大潛力。
• 在Protein A層析捕獲階段，可嘗試在洗脫緩沖液中加入氯化鈉或氯化鈣，同時(shí)配合5%PEG，以改善聚集體去除效果。
• 需根據(jù)抗體特性和聚集體含量，調(diào)整鹽和PEG的濃度，推薦先進(jìn)行小試驗(yàn)證。
• 雖然氯化鈣對分辨率有正面作用，但也可能對蛋白活性造成一定影響，需在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行條件篩選和參數(shù)優(yōu)化，進(jìn)行綜合評估。
可優(yōu)化參數(shù)
• PEG濃度范圍：e.g. 1.5%、3%、5%、10%
• 氯化鈣濃度范圍：e.g. 250mM、500mM、750mM、1M
• 氯化鈉濃度范圍：e.g. 250mM、500mM、600mM、750mM
• 在本文案例中，以500mM氯化鈣或750mM氯化鈉和5%PEG組合效果最佳，分離效果顯著提升。
方法優(yōu)勢
顯著提升去除效果
• 通過向洗脫緩沖液中添加500mM氯化鈣和5%PEG，洗脫液中的聚集體含量從20%降至3%~4%。
• PEG和氯化鈣/氯化鈉在合適濃度下表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，改善單體與聚集體的分離效果。
提升工藝穩(wěn)健性
• 該方法通過在Protein A捕獲階段減少聚集體含量，降低了后續(xù)精細(xì)純化的壓力，提升整體純化工藝的穩(wěn)健性。
小結(jié)
通過在Protein A層析洗脫液中添加PEG和氯化鈣/氯化鈉組合，可以顯著提升聚集體去除效果，同時(shí)保持抗體高回收率。該方法操作簡便，可直接應(yīng)用于現(xiàn)有工藝中，為抗體純化工藝的優(yōu)化提供了新思路。
相關(guān)產(chǎn)品信息
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參考文獻(xiàn)
[1] Yuan Zhang et al., A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability, Protein Expression and Purification 158 (2019) 65–73.
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