眾所周知，CAR-T結(jié)構(gòu)包括三部分：
1、
2、
3、
CAR-T細胞療法的發(fā)展。（圖片來自Journal of Controlled Release, 2020, 319:246-261.）
其中胞外區(qū)結(jié)構(gòu)決定了CAR的特異性和與靶抗原的結(jié)合親和力。隨著CAR-T的發(fā)展，逐漸發(fā)現(xiàn)單靶點CAR-T細胞療效受限于腫瘤抗原的異質(zhì)性，常出現(xiàn)腫瘤復發(fā)的問題，于是近年來逐漸向多靶點CAR-T細胞療法轉(zhuǎn)變，比如探索CD19/CD20雙特異性CAR治療復發(fā)難治性B細胞淋巴瘤等。
另外，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域近年來也做了不斷優(yōu)化。從二代CAR開始，就加入了不同的共刺激信號結(jié)構(gòu)域，以解決一代CAR在體內(nèi)存活時間較短，且活性差的問題。二代CAR-T技術(shù)依據(jù)不同的共刺激結(jié)構(gòu)域主要分為兩大類：基于CD28和基于CD137(4-1BB)的共刺激結(jié)構(gòu)域。一般認為，CD28所傳遞的活化信號相較于CD137(4-1BB)更強，可使T細胞在較短時間內(nèi)達到很高的殺傷活性。而CD137(4-1BB)所傳遞的活化信號則會更加持久。
到三代CAR-T同時引入兩個共刺激信號分子，以期提高T細胞增殖活性、細胞毒性，并延長T細胞存活時間。第四代CAR-T結(jié)構(gòu)引入了**基因、促炎癥細胞因子和共刺激配體等，希望達到精細調(diào)控和克服腫瘤免疫微環(huán)境抑制等目的。
關(guān)于如何將CAR-T胞外和胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域進行優(yōu)化，強強聯(lián)合，以提高CAR-T的作用，目前仍在探索中。
墨菲特癌癥治療及研究中心(H.Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute)Marco L Davila博士帶領(lǐng)的研究團隊新近在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（影響因子13.751）發(fā)表題為"4-1BB and optimized CD28 co-stimulation enhances function of human mono-specific and bi-specific third-generation CAR T cells "的研究文章表明，4-1BB和經(jīng)過優(yōu)化的CD28共刺激信號可增強三代單特異性CAR和雙特異性CAR的功效，包括細胞擴增、細胞持久性和抗耗竭能力等。
研究方法
作者設(shè)計了4-1BB或聯(lián)合僅含有PYAP信號基序(mut06)的CD28作為CD19特異性CAR-T細胞的共刺激信號，通過細胞和分子生物學體外和體內(nèi)實驗對不同設(shè)計結(jié)構(gòu)的CAR-T細胞進行評估，包括：
體外細胞分析：免疫表型、細胞因子分泌、實時細胞毒殺傷能力和CAR-T多功能性反應(yīng)；
體外蛋白定量：Western blot分析不同CAR-T的LCK募集情況；
小鼠體內(nèi)腫瘤模型實驗：在NOD scid γ (NSG)小鼠模型中分析CAR-T對Raji細胞腫瘤的控制。
此外，作者還結(jié)合4-1BB和mut06設(shè)計了雙特異性CD20/CD19 CAR，并采取以下實驗進行評估：
多次體外抗原刺激：分析細胞擴增能力、細胞記憶性表型、PD1+CD39+表型（細胞耗竭）；
小鼠腫瘤模型：在Raji或Nalm6小鼠腫瘤模型中研究雙特異性CAR-T細胞清除CD20/CD19腫瘤細胞的能力。
思路理清楚了，我們來看下研究結(jié)果吧~
研究結(jié)果
一
4-1BB和mut06共刺激可提高CAR-T細胞的記憶性表型
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為了評估4-1BB和mut06聯(lián)合刺激如何影響CAR功能，研究人員一共設(shè)計了5種CAR結(jié)構(gòu)，具體如下：
所有CAR結(jié)構(gòu)包括FMC63 scFv胞外區(qū)和CD8α跨膜鉸鏈結(jié)構(gòu)域，不同之處在于胞內(nèi)的共刺激信號。
h1906z (mut06)：與CD28子結(jié)構(gòu)域相比，h1906z用FMNM和ARRA取代了YMNM和PRRP，只留下一個功能性的PYAP信號基序；
h1906BBz：在細胞膜近端是mut06結(jié)構(gòu)域，然后依次是4-1BB和CD3ζ；
h19BB06z：在細胞膜近端是4-1BB結(jié)構(gòu)域，然后依次是mut06和CD3ζ。
將不同設(shè)計的CAR-T細胞與靶細胞(3T3-hCD19)以1:10的效靶比共培養(yǎng)24小時，流式檢測CAR-T細胞表型，結(jié)果顯示：
1
h19BB06z細胞表面的CAR表達水平最高，與靶細胞刺激前趨勢一致。
2
在與靶細胞共培養(yǎng)后，同時含有4-1BB和mut06共刺激信號的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）具有更高的CD4/CD8比例，同樣與靶細胞共培養(yǎng)前的趨勢一致。
3
在與靶細胞共培養(yǎng)后，同時含有4-1BB和mut06共刺激信號的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）細胞含有更高比例的中央記憶性T細胞(CCR7+CD45RA-)。
為了進一步驗證在更長時間點的細胞分化情況，研究人員每周用靶細胞刺激CAR–T，共計3周。結(jié)果顯示h19BB06z CAR-T細胞能夠保持更持久的高比例中央記憶性細胞表型，而其余的CAR-T偏向T細胞分化表型。
綜上，與其他CAR-T結(jié)構(gòu)相比，h19BB06z CAR-T細胞可以保持更持久、更高水平的中央記憶性細胞表型。
二
4-1BB和mut06共刺激結(jié)構(gòu)域影響h1906BBz和h19BB06z CAR-T細胞的功能
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對CAR-T細胞的功能檢測包括細胞因子定量、細胞多功能性檢測、體外殺傷實驗和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分析。
1
細胞因子檢測
為了檢查不同CAR的效應(yīng)功能，研究人員將三名健康人來源的CAR-T細胞與靶細胞以1:10的效靶比共培養(yǎng)24小時，收集上清檢測細胞因子含量。
結(jié)果顯示：
h1906z (mut06)的IFN-γ、IL-2和TNFα水平最低，與CD28結(jié)構(gòu)突變導致的信號傳導抑制和功能受損有關(guān)；
當4-1BB與mut06共刺激信號聯(lián)合時，細胞上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌增加，尤其是h19BB06z；
IL-6的分泌與患者的CRS相關(guān)，在所有CAR結(jié)構(gòu)中均保持較低水平，除了h19BB06z。
2
細胞多功能性檢測
此外，研究人員還探索了CAR-T細胞的多功能性，即單個細胞分泌兩種及以上細胞因子的能力。已有多項研究表明，CAR-T細胞的多功能性是體內(nèi)生理效應(yīng)的一個重要預測指標。為了驗證這一點，作者采用微流控芯片，在單細胞水平上分析了數(shù)百個CAR-T細胞分泌的28種細胞因子，包括分泌頻率和細胞因子強度。
將CAR-T細胞與靶細胞共培養(yǎng)4小時后加載到芯片進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)h1928z、h1906BBz和h19BB06z的多功能細胞百分比增加。細胞多功能指數(shù)（PSI）是衡量CAR-T細胞療效的預測性指標，通過計算多功能細胞的百分比乘以所分泌的各種細胞因子的強度獲得。采用這一檢測方法顯示，h1928z、h1906BBz和h19BB06z具有最高的PSI水平。這些數(shù)據(jù)說明4-1BB和mut06結(jié)合可以增強CAR-T細胞的多功能性，與h1928z相當。
3
體外殺傷能力檢測
所有CAR-T在兩種效靶比下（5:1和1:1）都具有快速有效的殺傷作用。這表明體外細胞毒作用不受共刺激域的選擇或組合的影響。
4
CAR-T細胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分析
淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(LCK)是影響CAR-T細胞功能的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導分子。最近有研究表明，LCK募集到4-1BB CARs可以增強CAR-T細胞的細胞毒性。研究人員對不同CAR在靶細胞刺激24h后的胞內(nèi)LCK磷酸化水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)與第二代CARs相比，第三代CARs的pLCK均有所增加。
而且，h19BB06z的LCK磷酸化水平最高，說明共刺激域的位置可能會影響pLCK。此外還發(fā)現(xiàn)大量的pLCK和總LCK與h19BB06z CAR分子相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，h1906BBz和h19BB06z的體外功能增強是由于pLCK的增加，共刺激區(qū)域的定位可影響CAR相關(guān)的LCK信號。
三
共刺激域定位影響細胞體外擴增和體內(nèi)腫瘤殺傷
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1
CAR-T體外持續(xù)擴增能力
衡量CAR-T細胞體內(nèi)功效的一種指標是在多輪抗原刺激后的擴增能力。鑒于此，研究人員用5:1效靶比的靶細胞刺激CAR-T細胞，每7天重復刺激一次，共計4周，檢測CAR-T細胞反應(yīng)性。
結(jié)果顯示在重復抗原刺激后，h19BB06z CAR - T細胞表現(xiàn)出最強的體外擴增能力、細胞毒作用和細胞因子分泌。
而h1906BBz CAR-T細胞比h19BB06z表現(xiàn)出更低的增殖、細胞毒作用和IL-2的產(chǎn)生，再次表明共刺激域定位可以影響CAR功能。
2
體內(nèi)抗腫瘤能力
為了確定h1906BBz和h19BB06z CAR-T細胞在體內(nèi)控制腫瘤生長的能力，研究人員將Raji B淋巴細胞腫瘤細胞注射到NSG小鼠體內(nèi)形成腫瘤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與UT和h1906BBz相比，h19BB06z CAR-T細胞能夠更好地控制腫瘤生長。在接受h19BB06z治療的小鼠血液中，CAR+細胞略有增加，CD19+細胞相應(yīng)減少。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，與h1906BBz相比，h19BB06z CAR-T細胞在體外增殖、長期細胞毒性和體內(nèi)腫瘤殺傷能力增強。因此，研究人員選擇BB06方向進行進一步的評估。
四
雙特異性CAR-T研究
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后續(xù)，研究人員開發(fā)了四種能夠識別人CD19和CD20抗原的雙特異性CAR（結(jié)構(gòu)設(shè)計如下），這種多抗原識別方法在以往研究中發(fā)現(xiàn)可以減緩由于腫瘤抗原逃逸引起的疾病復發(fā)。而且，這四種CAR-T包含二代或三代CAR結(jié)構(gòu)，以進行深入比較。
在后續(xù)研究中，作者依然采用了前文所述的不同研究方法對各種雙特異性CAR-T進行評估和比較，包括細胞表型、細胞因子分泌、細胞擴增和體外/體內(nèi)腫瘤殺傷能力等。
當然，除了常規(guī)細胞評估方法外，作者還采用了IsoPlexis單細胞功能蛋白組技術(shù)來評估細胞多功能性和PSI（細胞多功能指數(shù)）哦~
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