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?恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

來(lái)源勝創(chuàng)生物

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摘要：恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。目前主要的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、依賴核酸序列擴(kuò)增和解鏈酶擴(kuò)增。它們都具有共同的特點(diǎn)：恒溫、高效、特異、不需要特殊的儀器設(shè)備。本文就現(xiàn)階段恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用情況和前景做一綜述。

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關(guān)鍵詞：恒溫?cái)U(kuò)增；PCR

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引言：

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于核酸檢測(cè)的診斷方法已大量建立并廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)就是在此背景下出現(xiàn)的。與其它的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增有快速、高效、特異的優(yōu)點(diǎn)且無(wú)需專用設(shè)備。所以它一經(jīng)出現(xiàn)就被許多學(xué)者認(rèn)為是一種有可能與PCR?媲美的檢測(cè)方法，目前主要的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling?circle?amolification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）、鏈替代擴(kuò)增（strand?displacement?amplification，SDA）、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleicacid?sequence?based?amplification，NASBA）?和解鏈酶擴(kuò)增（helix?dependent?amplification，HAD），這些技術(shù)各有特點(diǎn)，這也決定了它們?cè)趧?dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用情況，下面就它們的原理、特點(diǎn)及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

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1?滾環(huán)核酸擴(kuò)增

1.?1?滾環(huán)核酸擴(kuò)增的原理

滾環(huán)核酸擴(kuò)增（rolling?circleamolification,?RCA）是通過(guò)借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA?的方式而提出的[1]，可分為線性擴(kuò)增與指數(shù)擴(kuò)增兩種形式。線性RCA?是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA?上后，在DNA?聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列（與環(huán)狀DNA?完全互補(bǔ)）的線狀單鏈。線性RCA?用于靶核酸擴(kuò)增僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體，線性擴(kuò)增倍數(shù)為105。指數(shù)RCA原理與線性RCA?相同，采用與環(huán)狀DNA?序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性RCA?產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針

的模板，這樣一來(lái)在很短的時(shí)間內(nèi)（1h），產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。指數(shù)RCA?可用于非環(huán)狀DNA?的擴(kuò)增，增倍數(shù)能達(dá)107?[2]。

1.?2?滾環(huán)核酸擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足

RCA?的優(yōu)勢(shì)：(1)?高靈敏度。RCA有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力，線性RCA?的效率可達(dá)到l05?倍，而指數(shù)RCA?的效率可達(dá)到109?倍，這一高靈敏度特性使其能夠檢測(cè)到單拷貝水平[3]；(2)高序列特異性。可以區(qū)分單一位點(diǎn)的不同模式；(3)?擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)磷酸化處理后可以直接用來(lái)測(cè)序。(4)高通量。RCA?可以在靶目標(biāo)上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RCA?產(chǎn)生的信號(hào)集中在一點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)原位擴(kuò)增和載片擴(kuò)增；?RCA?只要保證探針的識(shí)別段序列與靶序列互補(bǔ)，不需要考慮靶序列的性質(zhì)，因此檢測(cè)RNA?時(shí)不再需要預(yù)先進(jìn)行RNA?的逆轉(zhuǎn)錄。

RCA?的不足：（1）鎖式探針常接近100bp，?合成費(fèi)用較高。2000?年，Antson?DO?等采用PCR?方法在實(shí)驗(yàn)室合成探針，可以在很大程度上降低成本；（2）信號(hào)檢測(cè)時(shí)的背景問(wèn)題。在RCA?反應(yīng)過(guò)程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA?或者RNA?可能產(chǎn)生一些背景信號(hào)。

1.?3?滾環(huán)核酸擴(kuò)增在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

雖然可以通過(guò)一些方法部分克服RCA?的不足，但也進(jìn)一步增加了反應(yīng)成本，使得RCA?在動(dòng)物疾病的臨床檢測(cè)中不適合被采用。

2?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

2.?1?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的原理

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增其擴(kuò)增原理是基于DNA?在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA?的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈，在此前提下利用4?種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6?個(gè)特定區(qū)域，在鏈置換型DNA?聚合酶的作用下，以外側(cè)引物區(qū)段的3’末端為起點(diǎn)，與模板DNA?互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成[4]。

2.?2?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足

LAMP?的優(yōu)勢(shì)：（1）擴(kuò)增效率高，能夠在1h?內(nèi)有效的擴(kuò)增1-10?個(gè)拷貝的目的基因，擴(kuò)增效率為普通PCR的10?倍-100?倍；（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。

LAMP?的不足：（1）?對(duì)引物的要求特別高；（2）?擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆

測(cè)序，只能用于判斷；（3）由于其敏感性強(qiáng)，特別容易形成氣溶膠，造成假陽(yáng)性影響檢測(cè)結(jié)果。

2.?3?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP?技術(shù)從誕生之日起就被認(rèn)為是最有可能代替PCR?進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法。2008?年Anne-Lie?B?等應(yīng)用RT-LAMP建立了豬水皰病病毒(SVDV)的診斷方法[5]，該方法對(duì)血清樣本的敏感性相當(dāng)于實(shí)時(shí)PCR，對(duì)糞便樣品的敏感性優(yōu)于實(shí)時(shí)PCR。

3?鏈置換擴(kuò)增

3.?1?鏈置換擴(kuò)增的原理

鏈置換擴(kuò)增其原理是基于在靶DNA?兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將鏈DNA?打開(kāi)缺口，DNA?聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA?鏈[6]。被替換下來(lái)的DNA?單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過(guò)程不斷反復(fù)進(jìn)行，使靶序列被高效擴(kuò)增。SDA?的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA?聚合酶、兩對(duì)引物、dNTP?以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。

3.?2?鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與不足

SDA?的優(yōu)點(diǎn)：（1）?擴(kuò)增效率高，據(jù)Walker?等人的報(bào)道，采用SDA?擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌總DNA?中的一段序列時(shí)，37℃反應(yīng)2?小時(shí)后，可將靶序列擴(kuò)增106?倍[7]；（2）反應(yīng)時(shí)間短，特異性強(qiáng)，不需要特殊的設(shè)備。

SDA?的不足：（1）SDA?產(chǎn)物不均一。在SDA?循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測(cè)時(shí)必然要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。（2）SDA?產(chǎn)物不可能直接用于克隆，測(cè)序和表達(dá)。使得SDA?在基因工程方面沒(méi)有優(yōu)勢(shì)；（3）SDA?產(chǎn)物的檢測(cè)手段有待提高。目前SDA?產(chǎn)物檢測(cè)的主導(dǎo)方法是熒光偏振檢測(cè)，但該檢測(cè)方法需要特殊的檢測(cè)儀器----?熒光分光光度計(jì)，這限制了SDA?在臨床的廣泛應(yīng)用。

3.?2?鏈置換擴(kuò)增在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

當(dāng)前SDA?方法主要應(yīng)用于分枝桿菌核酸定性檢測(cè)、病毒體外進(jìn)化研究[23]和芯片雜交等方面，還沒(méi)有運(yùn)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)。

4?依賴核酸序列擴(kuò)增

4.?1?依賴核酸序列擴(kuò)增的原理

依賴核酸序列擴(kuò)增(NASBA)是在PCR?基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)。是由1?對(duì)帶有T7?啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)在41℃進(jìn)行，可在2?h?內(nèi)將模板RNA?擴(kuò)增109?