女人与狗锁死了视频大全|霍金死亡过程恐怖视频|无节社团简谱季免费观看|六间房直播大厅|中文字幕欧美另类精品|久久人人玩人妻潮喷内射人人|亚洲国产一区二区三区在线观看

更靈敏，更特異，更精確

——數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用簡(jiǎn)介

數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

數(shù)字PCR采用的策略概括起來(lái)非常簡(jiǎn)單，就是“分而治之”（devide and conquer）[1]，這種做法非常類似于計(jì)算機(jī)科學(xué)中的“分治算法”，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。在實(shí)際的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中，事實(shí)上是通過(guò)呈現(xiàn)兩種信號(hào)類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。

圖1. 數(shù)字PCR的原理（圖片來(lái)源http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/pcr/digital-pcr.html）

數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無(wú)需依賴于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷有/無(wú)兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過(guò)程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。

數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展歷史

從以上介紹我們可以看到，事實(shí)上數(shù)字PCR與傳統(tǒng)定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺(tái)基礎(chǔ)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雙鏈DNA標(biāo)記技術(shù)，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并沒(méi)有實(shí)驗(yàn)方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術(shù)并不準(zhǔn)確。

在實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），檢測(cè)了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進(jìn)行了極其精細(xì)的定量研究［2］，雖然當(dāng)時(shí)這種方法并沒(méi)有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實(shí)驗(yàn)流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則——以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)”（all-or-none end point ）作為判斷標(biāo)志，這也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digital PCR)的主要原因 [3]。

數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無(wú)法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一臺(tái)商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國(guó) Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測(cè)方式的BEAMing dPCR 檢測(cè)服務(wù)，但這些方法無(wú)論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無(wú)法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時(shí)間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。

近幾年來(lái)，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最佳契機(jī)。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用納升級(jí)芯片進(jìn)行單克隆模板PCR擴(kuò)增，獲得了美國(guó)**，更重要的是這種采用“電浸潤(rùn)法”進(jìn)行納升級(jí)芯片制造技術(shù)顯露雛形［4］。伴隨二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來(lái)的“油包水PCR”技術(shù)，可以一次生成數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。

QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù) 開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，這也是最早出現(xiàn)的相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，在運(yùn)行成本和實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達(dá)到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。2011年，QuantaLife 公司被BioRad公司收購(gòu)，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號(hào)儀繼續(xù)在市場(chǎng)上銷售，這個(gè)早期型號(hào)為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。

2012年，RainDance公司推出Raindrop型號(hào)數(shù)字PCR設(shè)備，這個(gè)設(shè)備將其原有的二代測(cè)序文庫(kù)制備平臺(tái)技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液， 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品” [1]。

2013年下半年，Life Technologies推出了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)， 這也是目前數(shù)字PCR市場(chǎng)上最新型號(hào)的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。在整個(gè)工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過(guò)程，簡(jiǎn)化操作步驟。同時(shí)芯片式設(shè)計(jì)避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問(wèn)題 [5]。

作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺(tái)之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，值得一提的是，這個(gè)全新的系統(tǒng)在設(shè)計(jì)理念上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運(yùn)行成本因素，直接反映了該系統(tǒng)“適合所有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用的數(shù)字PCR系統(tǒng)”的市場(chǎng)定位。

數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

從上世紀(jì)90年代以來(lái)qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測(cè)技術(shù)具有全新的面貌，而進(jìn)入二十一世紀(jì)之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測(cè)序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭(zhēng)取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應(yīng)用領(lǐng)域，也有一些實(shí)驗(yàn)室同時(shí)選擇dPCR平臺(tái)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)性 [5]。

在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測(cè)面臨的問(wèn)題主要是突變序列往往與大量正常序列同時(shí)存在，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變序列的檢測(cè)精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來(lái)的極高的擴(kuò)增特異性在稀有突變檢測(cè)方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，在癌癥標(biāo)志物檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測(cè)等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。

CNV（Copy Number Variations，拷貝數(shù)變異）研究需要極高的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，測(cè)序方法適用于高于30%的變異率檢測(cè)，而qPCR的最高分辨在1.5倍左右，數(shù)字PCR通過(guò)直接計(jì)數(shù)目標(biāo)基因與參照基因( 拷貝數(shù)為1的基因，例如RNaseP) 的數(shù)目，計(jì)算比值，直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)可以達(dá)到極高的拷貝數(shù)分辨精度 [5]。