影響因子：6.2
伯豪技術(shù)服務(wù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
研究背景
胃癌（GC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，預(yù)后普遍較差。胃癌干細(xì)胞（GCSCs）因其自我更新能力、異質(zhì)性分化潛能以及對化療和靶向治療的強(qiáng)耐藥性，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和治療抵抗的關(guān)鍵驅(qū)動因素。盡管靶向Wnt/β-catenin信號通路（GCSCs干性和耐藥性的核心調(diào)控通路）是極具前景的策略，但目前缺乏臨床可用的有效抑制劑。
主要技術(shù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
（技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）
實驗材料
人類GC細(xì)胞系（MGC-803、SGC-7901、BGC-823、MKN-45）；4至6周齡雄性裸鼠。
結(jié)論
通過高通量篩選臨床獲批藥物庫，發(fā)現(xiàn)抗生素藥物氯福克酚（Clofoctol, CFT） 能高效抑制β-catenin表達(dá)，顯著削弱GCSCs干性，并通過結(jié)合RanBP2蛋白誘導(dǎo)TNF介導(dǎo)的程序性壞死，為胃癌治療提供了新的候選策略。
實驗結(jié)果
1. 高通量篩選鑒定CFT為強(qiáng)效β-catenin抑制劑
篩選策略： 使用實時定量PCR（RT-qPCR）檢測206種FDA批準(zhǔn)的無明確靶點藥物對胃癌細(xì)胞系MGC-803中β-catenin mRNA水平的影響。
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：
10種藥物（4.85%）能將β-catenin mRNA抑制至對照組50%以下（圖1A, B）。
CFT表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制效果，顯著降低多個GC細(xì)胞系（MGC-803, SGC-7901, BGC-823, MKN-45）的β-catenin mRNA和蛋白水平（圖1C，附圖S1A）。
細(xì)胞效應(yīng)初探：
常規(guī)培養(yǎng)下，CFT（≤10 μM）在前48小時對細(xì)胞活力和凋亡無顯著影響（附圖S1B-D）。
營養(yǎng)應(yīng)激增強(qiáng)CFT效應(yīng)： 在低血清（1% FBS）模擬的微環(huán)境壓力下，CFT處理7天后顯著抑制GC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)S期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖1D-F，附圖S2A-C）。
協(xié)同化療： CFT與5-氟尿嘧啶（5-Fu）聯(lián)用表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)（附圖S2E, F）。
圖1. CFT在低血清培養(yǎng)基中抑制β-catenin和細(xì)胞生長
2. CFT有效抑制GCSCs干性及致瘤性
干性標(biāo)志物下調(diào)： CFT處理顯著降低干性相關(guān)基因（Nanog, Oct4, Survivin, Sox2, Lgr5）的mRNA表達(dá)（圖2A）。
自我更新能力受損：
體外球體形成： CFT處理顯著降低GC細(xì)胞形成腫瘤球體的頻率和能力（圖2B，附圖S3A, B）。
集落形成： CFT處理顯著減少GC細(xì)胞的貼壁依賴性集落形成單位（CFU）（圖2D）。
GCSCs標(biāo)志物減少： 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析顯示，CFT處理顯著降低CD44?/CD133?雙陽性細(xì)胞群以及高醛脫氫酶活性（ALDH?）細(xì)胞群的比例（圖2E, F，附圖S4A, B）。
體內(nèi)致瘤性減弱：
有限稀釋實驗： 將不同數(shù)量（10?, 10?, 10?）的GC細(xì)胞皮下接種裸鼠，CFT處理組形成的腫瘤更少、更小，表明CFT降低了具有腫瘤起始能力的細(xì)胞比例（圖2G）。
次級移植瘤實驗： 將CFT處理組來源的原代腫瘤細(xì)胞再次接種小鼠，形成的次級腫瘤數(shù)量和體積顯著小于對照組，證明CFT處理可長期抑制腫瘤再生能力（圖2H）。
遷移侵襲抑制： CFT通過下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白抑制GC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（附圖S5A-D）。
圖2. CFT在體內(nèi)和體外抑制GC細(xì)胞干性
3. CFT選擇性殺傷GCSCs并誘導(dǎo)凋亡/壞死
模型建立： 從4株GC細(xì)胞系和2例GC患者原代細(xì)胞中分離培養(yǎng)GCSCs。
選擇性殺傷：
CFT（10 μM）能顯著抑制6種不同來源GCSCs的活力，而同等劑量對普通GC細(xì)胞或正常細(xì)胞（HUVEC, 293T, GES-1, H9）影響甚微（圖3A-C，附圖S6A, B）。
GCSCs通常對化療藥5-Fu和順鉑（Cis）耐藥，但CFT對其表現(xiàn)出強(qiáng)效殺傷作用（圖3A）。
誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：
FCM（Annexin V/PI）和Calcein-AM/PI活死染色證實CFT顯著增加GCSCs的凋亡/死亡細(xì)胞比例（圖3D, E，附圖S6C, D）。
人凋亡抗體芯片： CFT處理改變多個凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，包括Caspase-3、HSP27、CytoC、FasL、Survivin和XIAP（圖3F，附圖S6E）。
活性氧積累： CFT誘導(dǎo)GCSCs內(nèi)活性氧（ROS）顯著累積（附圖S6F）。
體內(nèi)抗GCSCs活性：
裸鼠移植瘤模型： 將SGC-7901來源的GCSCs接種裸鼠，腫瘤體積達(dá)50 mm³后腹腔注射CFT（30 mg/kg/天，連續(xù)11天）。CFT顯著抑制腫瘤生長，且不顯著影響小鼠體重（圖4A-D）。
機(jī)制驗證：
免疫組化/免疫熒光：CFT處理組腫瘤中Cleaved Caspase-3表達(dá)升高（凋亡增加），CD44?/CD133?細(xì)胞比例降低（干性減弱）（圖4E-G）。
單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）： 分析CFT處理組腫瘤細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)具有高干性基因（NEAT1, COL7A1, MALAT1, IMMP2L）特征的細(xì)胞簇（Cluster 5）比例顯著減少，且該簇細(xì)胞處于分化早期（圖4H-K，附圖S7C-E）。
圖3. CFT抑制GCSC活率并誘導(dǎo)凋亡
圖4. CFT在體內(nèi)誘導(dǎo)GCSC凋亡
4. 分子機(jī)制：靶向RanBP2調(diào)控SerpinE1/β-catenin軸與TNF壞死通路
RNA-seq揭示關(guān)鍵通路：
CFT顯著下調(diào)SerpinE1（與GC不良預(yù)后正相關(guān)）表達(dá)（圖5B，附圖S9A-D）。
CFT顯著上調(diào)TNF表達(dá)，并富集到“細(xì)胞因子-受體相互作用”、“凋亡”和“壞死性凋亡”相關(guān)通路（圖5D-F，附圖S8C-F）。
蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析確認(rèn)TNF是調(diào)控凋亡/壞死網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點（圖5G）。
qRT-PCR驗證CFT上調(diào)多個壞死性凋亡相關(guān)基因（TNF, IL6, IL18等）（圖5H, I）。
圖5. SerpinE和TNF是CFT的靶點
SerpinE1是CFT抑制干性的關(guān)鍵下游因子：
回補(bǔ)實驗：在GC細(xì)胞中過表達(dá)SerpinE1，可部分逆轉(zhuǎn)CFT對β-catenin的下調(diào)作用（圖6A，附圖S9E-G）。
過表達(dá)SerpinE1顯著上調(diào)干性基因（Nanog, Oct4等）表達(dá)，并增強(qiáng)集落形成、球體形成和致瘤能力，而CFT處理能拮抗這些效應(yīng)（圖6B-G，附圖S9H, I）。
圖6. SerpinE1與CFT介導(dǎo)的GC細(xì)胞干性抑制有關(guān)
CFT激活TNF介導(dǎo)的程序性壞死（Necroptosis）：
CFT顯著上調(diào)GCSCs中TNF mRNA和磷酸化RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白水平（圖7B, C）。
使用特異性RIPK1抑制劑Necrostatin-1 (Nec-1) 可劑量依賴性地阻斷CFT誘導(dǎo)的TNF上調(diào)和細(xì)胞凋亡/壞死（圖7D, E），證明CFT通過TNF-RIPK1/RIPK3/MLKL通路誘導(dǎo)GCSCs壞死性凋亡。
圖7. CFT誘導(dǎo)TNF介導(dǎo)的GCSC壞死性凋亡
CFT直接靶向結(jié)合RanBP2：
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接： 預(yù)測出25個CFT潛在靶點，PPI網(wǎng)絡(luò)分析及GC表達(dá)數(shù)據(jù)提示RanBP2（SUMO E3連接酶）是關(guān)鍵候選靶點（圖8A，附圖S10A-H）。
分子對接： CFT通過氫鍵與RanBP2的PHE-110殘基穩(wěn)定結(jié)合（圖8B）。
DARTS驗證： CFT結(jié)合可保護(hù)RanBP2蛋白免受蛋白酶降解（圖8C）。
分子動力學(xué)（MD）模擬： 模擬CFT-RanBP2復(fù)合物100 ns動態(tài)，顯示復(fù)合物RMSD、Rg、RMSF值穩(wěn)定，結(jié)合自由能分解確認(rèn)PHE-110等殘基對結(jié)合貢獻(xiàn)大，證實兩者結(jié)合穩(wěn)定（圖8D-H，附圖S10I）。
功能驗證： 敲低RanBP2：
特異性降低SUMO1（而非SUMO2/3/4）蛋白水平（附圖S10K）。
逆轉(zhuǎn)CFT對SerpinE1、β-catenin和SUMO1的下調(diào)作用（圖8I），證明RanBP2是CFT發(fā)揮功能的上游靶點。
圖8. CFT與RanBP2結(jié)合調(diào)控靶蛋白
5. 機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建CFT療效預(yù)測模型
模型構(gòu)建：基于RNA-seq數(shù)據(jù)，應(yīng)用Lasso回歸（LR）、支持向量機(jī)（SVM）和隨機(jī)森林（RF）三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選特征基因。
核心基因：整合分析得到77個候選基因，進(jìn)一步結(jié)合TCGA胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，最終確定13個基因構(gòu)成預(yù)測模型（附圖S11A-C）。
預(yù)后價值：
根據(jù)風(fēng)險評分將TCGA胃癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。高風(fēng)險組患者總生存期（OS）顯著短于低風(fēng)險組（P=0.00336）（附圖S11D）。
多因素Cox回歸確認(rèn)年齡、腫瘤分期和風(fēng)險評分是獨立預(yù)后因素（附圖S11F）。
風(fēng)險評分對3年內(nèi)預(yù)后具有良好預(yù)測價值（ROC曲線下面積AUC=0.627）（附圖S11E, I）。
列線圖整合風(fēng)險評分與臨床特征，可直觀預(yù)測患者生存（附圖S11G, H）。
總結(jié)
靶點結(jié)合：CFT直接結(jié)合SUMO E3連接酶RanBP2。
干性抑制：通過RanBP2下調(diào)SerpinE1表達(dá)，進(jìn)而抑制β-catenin信號通路，削弱GCSCs干性、自我更新和致瘤能力。
誘導(dǎo)死亡：通過RanBP2激活TNF介導(dǎo)的RIPK1/RIPK3/MLKL依賴性程序性壞死途徑，選擇性殺傷耐藥性GCSCs。
預(yù)測工具：基于13個基因的機(jī)器學(xué)習(xí)模型可預(yù)測胃癌患者預(yù)后及潛在CFT治療反應(yīng)。
臨床轉(zhuǎn)化價值：
老藥新用：CFT作為已獲批的抗菌藥物，其安全性已知，重新定位用于胃癌治療可加速臨床轉(zhuǎn)化。
靶向GCSCs：CFT能有效清除對傳統(tǒng)化療耐藥的GCSCs，為克服胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了新策略。
聯(lián)合治療：CFT與化療藥物（如5-Fu）聯(lián)用展現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，具有臨床聯(lián)合用藥潛力。
圖9. 機(jī)制圖：CFT與RanBP2結(jié)合，誘導(dǎo)壞死性凋亡，抑制干性
參考文獻(xiàn)：
Liu Y, Ma Y, Zhou B, et al. Clofoctol impairs the stemness of gastric cancer and induces TNF-mediated necroptosis by directly binding to RanBP2. Cell Mol Life Sci. 2025;82:194.