支原體檢測(cè)試劑盒
本 支原體檢測(cè)試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測(cè) 到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm，最大發(fā)射波長為461nm。
貨號(hào)：CA1080
規(guī)格：1kit
保存：4℃保存，有效期為2年，Hoechst工作液需要避光保存。
試劑盒主要組成：
?????????????Hoechst 33258工作液?????????50ml
??????????????????固定液?????????????????50ml
?????????????抗熒光衰減封片液????????????10ml
??????????????????說明書?????????????????1份
結(jié)果判斷（參考）：
陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。
陽性：除細(xì)胞外，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
注意事項(xiàng)：
1．Hoechst工作液對(duì)人體有害，請(qǐng)注意防護(hù)。
2．固定液有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。
3．支原體檢測(cè)時(shí)，最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3代，這樣容易避免假陰性結(jié)果。
4．本試劑盒用于6孔板檢測(cè)時(shí)，可以進(jìn)行50次檢測(cè)反應(yīng)。
5．檢測(cè)支原體污染，可以使用支原體高效Vero細(xì)胞，這樣可以提高檢測(cè)靈敏度，即將被檢測(cè)樣品接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
操作步驟：?
貼壁細(xì)胞：
1、被檢細(xì)胞接種于無菌的 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為 1-2×104
。同時(shí)，接種正常無支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。
2、5 天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入 1ml 的固定液，靜置 20min，
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置 15-20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，加入 2ml 滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。?懸浮細(xì)胞：
1、收集需檢測(cè)的細(xì)胞，1500rpm，5min。
2、將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加 1ml 的固定液，靜置 20min。
3、吸去固定液，晾干。
4、于每孔中，加入 1ml 的 Hoechst33258 工作液（Hoechst 33258 工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置 15～20min 或室溫靜置 20～30min。
5、吸去 Hoechst 33258 工作液，用無菌水洗滌玻片 3 次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。
6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。
結(jié)果判斷（參考）：
陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。
陽性：除細(xì)胞外，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
注意事項(xiàng)：
1．Hoechst工作液對(duì)人體有害，請(qǐng)注意防護(hù)。
2．固定液有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。
3．支原體檢測(cè)時(shí)，最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng) 2～3 代，這樣容易避免假陰性結(jié)果。
4．本試劑盒用于 6 孔板檢測(cè)時(shí)，可以進(jìn)行 50 次檢測(cè)反應(yīng)。
5．檢測(cè)支原體污染，可以使用支原體高效 Vero 細(xì)胞， 這樣可以提高檢測(cè)靈敏度，即將被檢測(cè)樣品接種于 Vero
細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
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