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隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組和多重分析越來越流行，考馬斯藍(lán)染色及銀染已經(jīng)無法滿足更高的要求。此時，熒光染料的優(yōu)勢就凸顯出來。生物通這就帶大家看看市場上主流的蛋白熒光染料，包括總蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。另外，本文還會介紹一些特殊用途的熒光染料。

幾十年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）及相關(guān)的blot已經(jīng)成為蛋白分析的主流技術(shù)。考馬斯藍(lán)染色和銀染也就成了我們最熟悉的染色方法。不過，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組和多重分析越來越流行，這些染料已經(jīng)無法滿足更高的要求。此時，熒光染料的優(yōu)勢就凸顯出來。生物通這就帶大家看看市場上主流的蛋白熒光染料，包括總蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。另外，本文還會介紹一些特殊用途的熒光染料。

總蛋白染料

與傳統(tǒng)的考馬斯藍(lán)染色相比，熒光染色可將檢測的靈敏度降至1 ng以下，與銀染相當(dāng)；而與銀染相比，熒光蛋白染料的線性范圍比銀染寬很多，一般可達(dá)3個數(shù)量級以上，且對不同種蛋白的染色強(qiáng)度變化小，與蛋白質(zhì)量成清晰的線性關(guān)系，而不依賴于多肽序列及糖基化程度。目前的熒光染色法與后續(xù)的質(zhì)譜分析和Edman測序等技術(shù)兼容，因此無論在1D還是2D電泳領(lǐng)域都日漸受到研究人員的青睞。蛋白熒光染料需要一個紫外光透射儀（下紫外）才能觀察，當(dāng)然，有激光掃描儀時效果更佳。

名氣最大的總蛋白熒光染料當(dāng)屬Invitrogen旗下Molecular Probes公司持有**的SYPRO? 熒光蛋白染料系列。這一最早上市的熒光蛋白染料系列包括了SYPRO? Ruby，SYPRO? Red，SYPRO? Tangerine幾種不同顏色。其中紫紅色的SYPRO? Ruby最為著名，也有人翻譯成SYPRO紅寶石。它的檢測極限為0.25-1 ng，線性范圍超過3個數(shù)量級。它與堿性氨基酸和多肽主鏈結(jié)合，因此不同蛋白之間的差異性小，可進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定量。它的染色范圍包括糖蛋白、磷酸化蛋白、脂蛋白、鈣結(jié)合蛋白及其它難染色的蛋白，不會過度染色，也不干擾后續(xù)的質(zhì)譜分析和Edman測序等技術(shù)。操作起來也很簡單，固定兩次，染色過夜，脫色就OK了。如果你想快一點(diǎn)看到結(jié)果，可以用微波爐來快速染色，時間只需要1個半小時。SYPRO Ruby是即用型的1×染料，使用方便，當(dāng)然價格也不便宜。SYPRO Ruby有兩個激發(fā)峰-280 nm和450 nm，發(fā)射峰為～610 nm。紫外透射儀、藍(lán)光透射儀或激光掃描儀都可以觀察染色后的蛋白。

簡單而快速的SYPRO Red和SYPRO Tangerine通常用于1D電泳的凝膠染色。產(chǎn)品如其名，一種是鮮艷的正紅色，一種是明亮的金橘色。以Lonza公司（即原來FMC王牌瓊脂糖的電泳系列，賣給Cambrex后又被合并到Lonza旗下）的產(chǎn)品為例，取適量5000x濃度的原液稀釋為1x濃度，遮光浸泡凝膠40-60分鐘后即可上紫外透照儀，CCD或者激光掃描儀進(jìn)行檢測，無需額外的固定步驟，檢測下限可低至每條帶1ng蛋白。稀釋液在遮光4°條件下可以穩(wěn)定保存至少3個月。SYPRO Tangerine尤為值得推薦。這種熒光蛋白染料在整個使用過程中無須用到酸或者有機(jī)溶劑，染色可在saline或者PBS或Tris-HCL等多個體系的緩沖液中進(jìn)行，不與蛋白共價結(jié)合也不影響抗體結(jié)合，無需洗脫即可直接轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western Blotting，兼容后繼的酶法分析或者Western Blotting，特別適用于非變性膠的活性蛋白檢測。SYPRO Red則需要用乙酸溶液稀釋。這兩種染料在長時間UV光照下會發(fā)生光漂白，這時只要重新染色即可。這兩種染料價格差不多，500ul的5000x原液價格在2000多人民幣。

Bio-Rad公司的總蛋白染料有個很好聽的名字，火烈鳥-Flamingo Fluorescent Gel Stain。它的線性范圍也超過3個數(shù)量級，靈敏度似乎比SYPRO Ruby更高，在激光掃描模式下它的檢測極限能達(dá)到30 pg。染色所需時間為5小時，且著色深淺對染色時間不敏感，無需脫色。Bio-Rad沒有提供快速染色的protocol，雖然手工操作的時間很少，但5小時還是略嫌稍長。染過的凝膠在2-8℃下可保存6個月而無明顯褪色。Flamingo染料的最大激發(fā)峰和發(fā)射峰分別為512 nm和535 nm，不過在271 nm有第二激發(fā)峰，也可用紫外光激發(fā)。

Pierce（現(xiàn)屬于賽默飛世爾科技）的Krypton Protein Stain 名字雖不起眼，也是市場上很受歡迎的一款蛋白染料。就檢測靈敏度和線性范圍而言，它與前兩款不分伯仲。它的一個明顯優(yōu)勢就是染色時間較短，雖說步驟有些繁瑣，但整個過程只需要2小時40分鐘。另外，它也提供了快速染色的步驟，只要半個小時就能看到結(jié)果了，當(dāng)然，時間快了靈敏度也會打折扣。Krypton Protein Stain的性價比很高，在這三種熒光染料中，它是最便宜的。它與Flamingo都是10×的濃縮液，使用前需要用水稀釋。

產(chǎn)品名稱SYPRO Ruby Protein Gel StainFlamingo Fluorescent Gel StainKrypton Protein Stain。?

檢測極限0.25-1 ng0.25-0.5 ng≦0.25 ng??

線性范圍>3個數(shù)量級>3個數(shù)量級3-4個數(shù)量級。

染色步驟

（標(biāo)準(zhǔn)）1. 在甲醇、乙酸中固定1小時 2. 過夜染色

3. 在甲醇、乙酸中洗滌30分鐘1. 在甲醇、乙酸中固定2小時

2. 染色至少3小時

3. 在吐溫20中洗滌30分鐘1. 在甲醇、乙酸中固定1小時?

3. 染色1小時以上

4. 在乙酸中脫色5分鐘

5. 水洗30分鐘

耗時（標(biāo)準(zhǔn)）～18小時5小時2.7小時?

耗時（快速）1.5小時無0.5小時

質(zhì)譜兼容是

規(guī)格*1 L（1×）100 ml（10×）100 ml（10×）?

除了最常見的凝膠染色，SYPRO? Ruby還可用于等電聚焦IEF，且只需進(jìn)行一次20分鐘的固定（1D不用固定，但等電點(diǎn)聚焦IEF則需要固定3小時），染色3個小時（IEF需要染過夜），脫色30分鐘后即可觀察。Lonza這個產(chǎn)品1L的即用型原液價格要3000左右。值得注意的是SYPRO? Ruby在整個使用過程都要遮光，且應(yīng)用聚丙烯類塑料盤染色，避免使用玻璃。SYPRO? Ruby染色結(jié)果經(jīng)過2%甘油浸泡后可以進(jìn)行干膠永久保存，只是極低濃度的條帶就可能看不到了。另外還有個小秘密，Lonza的說明書里提及由于甲醇和乙酸混合可能產(chǎn)生乙酸乙酯，對后繼的質(zhì)譜可能有影響，后面考慮做質(zhì)譜的同學(xué)或許需要考慮用其他替代。?

另外，Invitrogen還有一種SYPRO Ruby protein blot stain，是專門染膜的，作用就像麗春紅。但它的優(yōu)點(diǎn)是不與蛋白共價結(jié)合，也就不影響后續(xù)的鑒定過程，因此可用于免疫染色之前，來定位分子量標(biāo)準(zhǔn)或看看樣品的總蛋白圖譜，這樣就免去了平行跑兩塊膠的麻煩，輕松比較總蛋, 白和目的蛋白。它還與后續(xù)的測序和質(zhì)譜分析兼容。只需染色15分鐘，SYPRO Ruby protein blot stain就能檢測PVDF或NC膜上的2-8 ng/條帶。膜染料還有一種，名字也相當(dāng)好聽，SYPRO Rose Plus Protein Blot Stain，靈敏度與Ruby不相上下，不過染色是可逆的。通過膜的洗滌，染料很容易就被完全剝離，這就很適合于臨時的檢測，比如蛋白芯片中的質(zhì)量控制。這兩個膜染料的價位都在兩千出頭，可用于1600 cm2的印跡膜。

?2D DIGE

?說到熒光，又談到2D，那怎么能忘了正流行的2D DIGE呢。熒光差異凝膠電泳技術(shù)是在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ稍谕粔K膠上同時分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品。由于不同的熒光標(biāo)記樣品有不同的激發(fā)波長，可通過不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結(jié)果。由于有了多色熒光標(biāo)記，使得在同一塊膠中分離并分析多個樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統(tǒng)誤差，特別適合比較不同樣本間差異。

熒光染料種類雖多，但用于蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記的熒光染料不同于普通熒光染料，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不應(yīng)該有等電點(diǎn)上的改變，分子量上的改變也應(yīng)該保持最小，而且不同熒光染料導(dǎo)致的分子量的改變應(yīng)該一致。用于蛋白質(zhì)預(yù)先標(biāo)記的熒光染料分為兩類，最小標(biāo)記和飽和標(biāo)記。其中最小標(biāo)記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團(tuán)－NHS脂，可以特異性的標(biāo)記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不會發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標(biāo)記會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基被熒光標(biāo)記修飾，才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標(biāo)記樣品時，保證合適的蛋白質(zhì)和染料的摩爾數(shù)比例至關(guān)重要。通過調(diào)整合適的pH值、合適的染料和蛋白質(zhì)的摩爾比，可以保證每個蛋白質(zhì)分子最多只標(biāo)記上一個染料分子，來保證蛋白質(zhì)的分子量變化最小。

飽和標(biāo)記的熒光染料包括兩種，標(biāo)記蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基，主要用于一些來源和珍貴的微量樣品的研究中。飽和標(biāo)記可避免上述問題，但是使用成本較高。在采用飽和標(biāo)記分析蛋白質(zhì)組樣品時，必須先進(jìn)行染料量的滴定，以確定合適的還原劑和染料的加量，否則，在DIGE膠圖上很輕易造成水平鏈狀的點(diǎn)或垂直拖尾。另外，由于被標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的分子量發(fā)生了改變，飽和標(biāo)記的膠圖和銀染的膠圖有所不同。