Annexin V-mCherry/SYTOX Green細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Cell Apoptosis Detection Kit with Annexin V-mCherry and SYTOX Green)是一種用細(xì)胞凋亡熒光探針Annexin V-mCherry聯(lián)合死細(xì)胞綠色熒光探針SYTOX Green來檢測(cè)細(xì)胞凋亡及壞死的一種試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
本試劑盒檢測(cè)的是Annexin V-mCherry紅色熒光和SYTOX Green的綠色熒光，Annexin V-mCherry熒光蛋白的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為587nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為610nm；SYTOX Green插入DNA后最大激發(fā)光波長(zhǎng)為504nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為523nm。Annexin V-mCherry和SYTOX Green的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。
圖1. Annexin V-mCherry和SYTOX Green的激發(fā)和發(fā)射光光譜。
細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡方式。當(dāng)細(xì)胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時(shí)，啟動(dòng)基因調(diào)控的**保護(hù)措施，去除體內(nèi)非必需細(xì)胞或即將發(fā)生特化的細(xì)胞。在這一過程中，細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細(xì)胞自主死亡，包含一系列信號(hào)事件組成的通路。細(xì)胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
細(xì)胞凋亡通過特征性的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化而區(qū)別于壞死(Necrosis)，包括細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)位于細(xì)胞膜的近細(xì)胞質(zhì)面。而在凋亡細(xì)胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細(xì)胞表面即細(xì)胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細(xì)胞外部。在白細(xì)胞的凋亡過程中，白細(xì)胞表面的PS標(biāo)記可以被巨噬細(xì)胞識(shí)別，從而最終被巨噬細(xì)胞吞噬。人血管抗凝血?jiǎng)〢nnexin V是一種35-36kDa Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高親和力。用紅色熒光蛋白的mCherry標(biāo)記的Annexin V (Annexin V-mCherry)染色細(xì)胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等熒光檢測(cè)設(shè)備非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。需要指出的是對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性被破壞，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS也會(huì)被Annexin V-mCherry染色。
Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
SYTOX Green是一種非細(xì)胞膜滲透性的花菁熒光染料，不能穿過具有生物活性的細(xì)胞質(zhì)膜，只能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋形成SYTOX Green-DNA復(fù)合物，熒光強(qiáng)度增加500倍以上，從而產(chǎn)生明亮的綠色熒光，因此SYTOX Green僅能對(duì)死細(xì)胞染色，從而被用來區(qū)分正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞。
Annexin V-mCherry相比藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡(jiǎn)稱PE)標(biāo)記的Annexin V，激發(fā)光譜更窄，不會(huì)像PE那樣在495nm左右產(chǎn)生紅色熒光，非常適合與其它綠色熒光一同檢測(cè)，在進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí)幾乎不需要進(jìn)行任何補(bǔ)償。
本產(chǎn)品使用便捷，結(jié)果清晰。正常細(xì)胞不會(huì)被Annexin V-mCherry和SYTOX Green所染色，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞都會(huì)被Annexin V-mCherry所染色，壞死細(xì)胞的細(xì)胞核被SYTOX Green染成明亮的綠色熒光。有報(bào)道稱，凋亡中晚期細(xì)胞的細(xì)胞核被SYTOX Green染成較弱的綠色熒光。使用本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的效果參考圖2。
圖2. Annexin V-mCherry/SYTOX Green細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)BGC-823 (人胃癌細(xì)胞)細(xì)胞凋亡和壞死的效果。正常狀態(tài)的BGC-823細(xì)胞在明場(chǎng)下的形態(tài)見圖A；正常細(xì)胞不會(huì)被Annexin V-mCherry和SYTOX Green所染色(圖B-D)。Camptothecin誘導(dǎo)16小時(shí)后的BGC-823細(xì)胞在明場(chǎng)下的形態(tài)見圖E；凋亡和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜呈紅色熒光(圖G-H)；凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核成較弱的綠色熒光，壞死細(xì)胞的細(xì)胞核呈明亮的綠色熒光(圖F)。實(shí)際檢測(cè)效果會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。
一個(gè)小包裝的本試劑盒C1070S共可以檢測(cè)20個(gè)樣品，中包裝的試劑盒C1070M可以檢測(cè)50個(gè)樣品。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1070S-1 | Annexin V-mCherry | 100μl |
| C1070S-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 12ml |
| C1070S-3 | SYTOX Green Staining Solution | 20μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1070M-1 | Annexin V-mCherry | 250μl |
| C1070M-2 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 30ml |
| C1070M-3 | SYTOX Green Staining Solution | 50μl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry和SYTOX Green Staining Solution避光保存。
注意事項(xiàng)：
如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-mCherry，最終導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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