?1.需要用戶自己準(zhǔn)備的耗材和試劑a.PBS C0221A，或PBS (pH7.2-7.6)。
b.固定液(免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)。
c.洗滌液(免疫染色封閉液P0102，QuickBlock?免疫染色封閉液P0260，或含3% BSA的PBS)。
d.通透液(免疫染色強(qiáng)力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e.去離子水或超純水。
f.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板，或流式細(xì)胞分析儀用管子(如12×75mm)。
2.檢測(cè)體系的準(zhǔn)備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測(cè)體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測(cè)體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b.如果檢測(cè)的是懸浮細(xì)胞，請(qǐng)按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等，如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對(duì)于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會(huì)影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計(jì)終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時(shí)。該孵育時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率，通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對(duì)于常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等，細(xì)胞周期大約在18-25小時(shí)，孵育時(shí)間宜在2小時(shí)左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘，推薦的孵育時(shí)間為5分鐘；酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時(shí)，推薦的孵育時(shí)間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天，推薦的孵育時(shí)間為1天。孵育時(shí)間小于45分鐘時(shí)，建議提高EdU的濃度；孵育時(shí)間大于20小時(shí)時(shí)，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e.EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。注：對(duì)于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.轉(zhuǎn)步驟5。
4.動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動(dòng)物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例，其它動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a.對(duì)于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨(dú)購(gòu)買ST067。
b.4小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c.對(duì)于冰凍切片：
(a)加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如P0090冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X)，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f)轉(zhuǎn)步驟5。
d.對(duì)于石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無(wú)水乙醇5分鐘，換新的無(wú)水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(fù)(選做)：如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，例如P0081檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0083改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0085 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、P0088通用型強(qiáng)力抗原修復(fù)液(10X)、P0092漂片抗原修復(fù)液(10X)，或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c)轉(zhuǎn)步驟5。
5.EdU檢測(cè)
注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對(duì)于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對(duì)于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來(lái)的負(fù)面影響。對(duì)于切片，可以根據(jù)切片大小，每個(gè)切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說明具體的操作方法，對(duì)于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可，其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution：對(duì)于C0071S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對(duì)于C0071L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請(qǐng)嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點(diǎn)擊反應(yīng)可能無(wú)法有效進(jìn)行；同時(shí)，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。
| 組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
| Click Reaction Buffer | 430μl | 860μl | 1.72ml | 2.15ml | 4.3ml | 10.75ml | 21.5ml |
| CuSO4 | 20μl | 40μl | 80μl | 100μl | 200μl | 500μl | 1ml |
| Azide 488 | 1μl | 2μl | 4μl | 5μl | 10μl | 25μl | 50μl |
| Click Additive Solution | 50μl | 100μl | 200μl | 250μl | 500μl | 1.25ml | 2.5ml |
| 總體積 | 500μl | 1ml | 2ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml | 25ml |
c.去除上一步驟中的洗滌液。
d.每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
g.如果需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，可以參照步驟6進(jìn)行。如無(wú)其它的特殊需要，即可在熒光顯微鏡下觀察，或者使用流式細(xì)胞儀、多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，或者用高內(nèi)涵篩選儀器(一般高內(nèi)涵篩選需要使用染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色)進(jìn)行檢測(cè)。Azide 488的最大激發(fā)波長(zhǎng)是495nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是519nm。
6.細(xì)胞核染色
為了檢測(cè)細(xì)胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。一般高內(nèi)涵篩選儀器也需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
e.隨后即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm。
7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)
對(duì)于經(jīng)步驟5或6獲得的細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行流式檢測(cè)。如果使用傳統(tǒng)的流體動(dòng)力學(xué)聚焦的流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)量總DNA含量，請(qǐng)?jiān)跈z測(cè)過程中使用低流速，實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)樣品應(yīng)使用相同的收集速率和細(xì)胞濃度。EdU標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號(hào)一般使用對(duì)數(shù)刻度的橫坐標(biāo)(如圖4中的橫坐標(biāo))。Azide 488的最大激發(fā)波長(zhǎng)是495nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是519nm。
注1：建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的陰性對(duì)照，并選擇合適的電壓。
注2：由于流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較靈敏，可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)際染**況對(duì)Azide 488的使用量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。